[發明專利]一種耐熱裂解酶TSPpgh和編碼此酶的多核苷酸

有效

• 申請號: 201310363245.6
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103436514A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 林連兵;谷豐;陳美杉;魏云林;季秀玲;張琦
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

????本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種耐熱裂解酶TSPpgh，以及編碼此酶的核酸序列。?

背景技術

裂解酶為噬菌體感染宿主后表達釋放的一類細胞壁水解酶，通過水解細胞壁肽聚糖而使細菌裂解，并釋放出子代噬菌體。根據作用于細胞壁肽聚糖共價鍵位點不同，可以將噬菌體裂解酶分為三類，葡萄糖苷酶(glucoseidase)、酰胺酶(amidase)、內肽酶(endopeptidase)，它們分別水解氨基糖之間的糖苷鍵，N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的酰胺鍵以及肽交聯橋。?

目前，很多裂解酶的結構得到了深入研究，分歧桿菌噬菌體裂解酶蛋白分為3個區域，典型的C-端區，與噬菌體內肽酶的C-端細胞壁結合區功能相關；中心區域，包含一個與肽聚糖水解酶相關的結構及N-端區域，常為一系列編碼肽酶功能的蛋白，它們每個結構域類型均有明顯差別，研究已發現6種可能的N-端肽酶結構區，5種酰胺酶/糖苷酶結構區，和4種C-端細胞壁結合結構區，可能出現的組合至少120種，其中絕大多數結構分布包含一個N-端肽酶結構區，一個中心酰胺酶/胞壁質酶或糖苷轉移酶區及C-端區，但是有一個例外，Myrna?gp243沒有C-端結合區，目前還沒有來源于棲熱菌高溫噬菌體裂解酶的報道。?

近年來，隨著抗生素大量濫用，逐漸出現了很多耐藥性菌株帶來的各種問題，人們迫切需要研究新型的抗菌試劑，而細菌的天敵噬菌體給人們提供了一個全新的思路，使人們逐漸開始多方面探索噬菌體裂解酶的抗菌作用。其中裂解酶作為新型抗菌制劑，能夠對細菌進行防治、治療并具有獨特的優點。首先，噬菌體裂解酶不會對動物產生毒副作用，因為它只能作用于病原菌宿主而對其他細菌不產生作用。其次，噬菌體裂解酶的催化結構作用于病原宿主菌的細胞壁肽聚糖，病菌對它不會產生耐藥性，同時能夠與抗生素聯合用藥，共同發揮作用。2001年Nelson等人實驗證明通過重組噬菌體裂解酶純化能夠預防和治療A型鏈球菌引起的小鼠粘膜感染。裂解酶能高效裂解細菌，可以抑制細菌的生長，使其有望取代傳統的抗生素治療，特別是對多重耐藥性致病菌，也可作為抑菌劑使用于環境的殺菌。?

發明內容

本發明旨在提供一種耐熱裂解酶TSPpgh，該裂解酶能夠抑制革蘭氏陽性和陰性細菌的生長，其在40~80℃范圍內具有催化活性，其來源于棲熱菌（Thermus）噬菌體TSP4，該耐熱裂解酶TSPpgh的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，或具有與SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列至少90％的相同性的多肽、類似物或衍生物。?

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本發明的另一個目的是提供編碼耐熱裂解酶TSPpgh的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，或其互補序列，或具有與SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列至少80％相同性的多核苷酸及其互補序列。

本發明的有益效果：?

本發明提供的耐熱裂解酶能高效裂解細菌，可以抑制細菌的生長，使其有望取代傳統的抗生素治療，特別是對多重耐藥性致病菌，也可作為抑菌劑使用于環境的殺菌。

目前報道的裂解酶多為常溫型裂解酶，在常溫下具有較高活性，本發明所述裂解酶在40~80℃范圍內均具有催化活性，在66.5℃催化活性最高，可適用于高溫環境的殺菌，目前未見來源于高溫噬菌體的裂解酶報道，其核苷酸序列可用于構建生產此裂解酶的基因工程菌株。?

附圖說明

圖1是本發明耐熱裂解酶TSPpgh基因PCR產物電泳示意圖，其中M代表Marker，泳道1為TSPpgh基因PCR產物，其大小為501bp；?

圖2是本發明中重組質粒TSPpgh/pET28a雙酶切圖譜示意圖，其中M代表Marker，泳道1為重組質粒TSPpgh/pET28a雙酶切后產生的兩個條帶；

圖3是本發明中耐熱裂解酶TSPpgh的蛋白表達檢測示意圖，其中泳道1為蛋白Marker，泳道2為總蛋白，泳道3為空載pET28a/BL21空載沉淀，泳道4為pET28a-TSPpgh/BL21誘導前沉淀，泳道5為pET28a-TSPpgh/BL21誘導后沉淀，泳道6為pET28a/BL21空載上清，泳道7為pET28a-TSPpgh/BL21誘導前上清，泳道8為pET28a-TSPpgh/BL21誘導后上清；

圖4是本發明耐熱裂解酶TSPpgh蛋白的純化結果檢測示意圖，其中1為蛋白Marker，2為上柱后500mM的磷酸緩沖液過柱后第二管，3為上柱后500mM的磷酸緩沖液過柱后最后一管，4為pET28a/BL21空載，5、6為pET28a-TSPpgh/BL21誘導后上清，7為TSPpgh總蛋白；