[發明專利]一種牛新孢子蟲病與弓形蟲病內標多重PCR檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310362385.1
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103409543A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 季新成;彭武麗;王振寶;于學輝;史茜;王科珂;員麗娟;段曉東
• 申請（專利權）人: 新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

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技術領域

本發明涉及動物檢驗檢疫技術領域，具體的，本發明涉及一種用于牛新孢子蟲病與弓形蟲病內標多重PCR檢測試劑盒的技術領域。

背景技術

牛新孢子蟲病（Neosporosis）是由犬新孢子蟲（Neospora?caninum，N．caninum）寄生在宿主體內所引起的一種原蟲病，該病的中間宿主為牛、綿羊、山羊、犬、馬、鹿小鼠等溫血動物，終極宿主為犬，主要造成孕畜流產、死胎及新生仔畜運動神經系統疾病，可垂直傳播，一年四季均發病，該病對牛的危害尤為嚴重，是世界上許多地區造成奶牛流產、弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一。牛弓形蟲病（Toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma?gondii,T.?gondii）引起的一種人獸共患寄生蟲病，貓為終宿主，人及動物為中間宿主，引起的流產可發生在奶牛妊娠的各階段。這兩種病呈世界性分布，給畜牧業造成巨大的經濟損失。高效快速的檢測方法，對于該病的早發現，早防治具有重要作用。?

目前，牛新孢子蟲病和弓形蟲病常用的檢測方法有病理組織檢測、病原學檢測和血清抗體檢測。但由于犬新孢子蟲與剛地弓形蟲的形態結構相似，二者都可以引起奶牛的流產、死胎以及神經系統障礙，且二者存在交叉抗原，有些血清學檢測方法會出現交叉反應；臨床上這兩種病原常存在混合感染，且癥狀相近，往往難以區分檢測。

PCR檢測技術具有快速、靈敏、特異等優點，目前，已有很多采用PCR方法檢測這兩種病的報道。研究表明，臨床標本如血清、全血、組織和分泌物等樣品中含有大量的未知成分，會造成對PCR擴增的抑制，核酸抽提過程中試劑的殘留也會抑制PCR擴增，從而導致假陰性結果或定量值偏低。另一方面，核酸提取過程中的丟失，也會造成假陰性結果。所以，對檢測過程進行質量監控至關重要。

經檢索，國內外未見有關檢測靈敏度高，特異性好，操作方便，且通過內標的添加，指示并校準假陰性結果，能夠同時檢測牛新孢子蟲病與弓形蟲病的內標多重PCR檢測方法的報道。因此，探索和研究檢測靈敏度高，特異性好，操作方便且能夠指示并校準假陰性結果的方法，對于及時準確有效的檢測新孢子蟲病和弓形蟲病，保護畜牧業健康發展、促進我國農產品出口和保護我國在國際貿易中的良好形象等方面均具有重要意義。

發明內容

針對目前國內外未見有關檢測靈敏度高，特異性好，操作方便且能夠指示并校正假陰性結果，提高檢測結果的準確率，能夠同時對牛新孢子蟲病和弓形蟲病進行檢測的內標多重PCR方法，本發明提供一種牛新孢子蟲病與弓形蟲病內標多重PCR檢測試劑盒，通過引物設計，用單重PCR擴增，獲得了新孢子蟲、弓形蟲和擴增內標的PCR模板，并對反應條件進行了優化，建立了含有內標物的多重PCR檢測體系，檢測靈敏度高、特異性好、試驗周期短，且能夠指示并校正假陰性結果，實現了對牛新孢子蟲病與弓形蟲病單獨檢測或同步檢測，且可對檢測結果進行質量監控，從而實現對牛新孢子蟲病和弓形蟲病的靈敏、高效、快速、準確檢測。?

本發明的主要技術方案：通過提供一種牛新孢子蟲病與弓形蟲病內標多重PCR檢測試劑盒，建立了一種牛新孢子蟲病和弓形蟲病的檢測方法，采用在雙重PCR反應體系中引入指示假陰性的內標（internal?amplification?control，IAC），通過引物設計和PCR擴增，經反應條件優化，成功的建立了含有內標的多重PCR反應體系，可以對核酸提取和PCR擴增過程進行監測，顯示抑制成分的存在，指示假陰性結果的發生，確保檢測質量。

本發明具體提供一種牛新孢子蟲病與弓形蟲病內標多重PCR檢測試劑盒，所述的試劑盒按50次反應體系組裝由以下成分組成：試劑盒反應體系為，0.5mL?PCR擴增試劑混合液，包括Tris-HCl?pH8.4，?40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄?20mmol/L、Mg²⁺4.0?mmol/L、dNTP4.0?mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/?GRA-R和PRL-F/?PRL-R分別為0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL?Taq酶75U；去離子水1.0mL；所用的檢測引物為：

（1）新孢子蟲檢測引物：

上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG