[發明專利]重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白及該蛋白抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201310362187.5
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103451187A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 華權高;劉瑾;易汪雪;閆彩霞;馬峰;沈鶴霄;舒芹
• 申請（專利權）人: 武漢華美生物工程有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K16/18;C07K16/06
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉杰

1.一種重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白，其特征在于，該蛋白的基因序列為SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種要求1所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白NGAL抗原表位分析：通過抗原表位分析選擇目的片段用作蛋白重組表達，所述目的片段為序列表中SEQ?ID?NO.1所述蛋白質序列；

（2）重組NGAL的合成：將選定的目的片段通過PCR擴增后插入到表達載體，然后進行轉座，最后轉染宿主細胞，病毒在復制的同時，目的蛋白也將得到表達；

（3）重組NGAL的分離純化:采用Ni柱純化，包括蛋白提取和蛋白純化；

（4）制備兔抗重組NGAL抗體：用步驟（3）純化后的重組NGAL作為抗原去免疫兔子，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。

3.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）后，對抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化，得到抗重組NGAL抗體干粉。

4.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述NGAL蛋白質序列的引物信息為SEQ?ID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。

5.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）中表達載體選自為pFastBacTM?1、pFastBacTM?HTA、pFastBacTM?HTB、pFastBacTM?HTC和pFastBacTM?Dual。

6.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（2）中轉染的宿主細胞為昆蟲細胞系，所述昆蟲細胞系為昆蟲sf9細胞系。

7.根據權利要求2或6所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（3）中蛋白提取為：收集培養的細胞系，離心棄上清；沉淀細胞用NTA-0緩沖溶液溶解；向緩沖體系中加入溶菌酶，置冰上處理一段時間；將反應體系倒入燒杯中于冰上超聲處理；后用離心機離心取上清再離心一次，后過0.22μm的濾膜；蛋白純化為：取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗滌Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-0緩沖溶液洗滌Ni柱；后用NiSO4洗滌Ni柱，流干；再用NTA-0緩沖溶液洗滌Ni柱至流出液與NTA-0緩沖溶液pH值相同；以1mL/min速度上樣；用NTA-0緩沖溶液洗滌至G250不變藍為止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至檢測G250不變藍為止，分別收集流出液體，跑膠分析溶液中重組NGAL純度。

8.根據權利要求2所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）兔抗重組NGAL抗體的制備為：取重組NGAL與等體積的完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500μg/只，首次免疫注射后第2周進行一次加強免疫注射，以后每隔兩周加強免疫注射一次，每次加強免疫注射劑量與首次免疫注射劑量相同，加強免疫時取重組NGAL與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量為500μg/只，靜脈采血，得到含抗重組NGAL抗體的抗血清。

9.根據權利要求8所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟（4）可以采用羊來制備羊抗重組NGAL抗體。

10.根據權利要求3所述的重組中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白抗體的制備方法，其特征在于，所述抗重組NGAL抗體的抗血清進行分離純化為：1）制備NGAL親和層析柱：將NGAL蛋白與壓積CNBr-Sepharose4B混合，依次經過交聯、清洗、封閉、再次清洗、裝柱、平衡，得到NGAL親和層析柱；2）親和層析：將NGAL抗體溶液通過1）所制備的親和層析柱，去除非特異性吸附后進行解吸，分段收集解吸液；3)抗體獲取：將2）收集解吸液，透析，冷凍干燥，得到NGAL抗體干粉。