[發明專利]制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用

無效

• 申請號: 201310362164.4
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN104419658A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 林雄斌;林柳吟
• 申請（專利權）人: 林雄斌
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/076;A01N1/02;A61K35/52;A61K35/545;A61P15/00;A61L27/38
• 代理公司: 北京德恒律治知識產權代理有限公司 11409
• 代理人: 章社杲;孫征

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體來說，涉及制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法、試劑盒、干細胞及應用。?

背景技術

干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞是一類具備無限自我更新和分化潛能的早期胚胎細胞，是當受精卵分裂發育成囊胚時內層細胞圖案的細胞，其具有可以向各胚層范疇的細胞分化的能力。成體細胞是指存在于人和哺乳動物特定組織或器官中（包括骨髓、神經、肌肉、表皮、睪丸或腎臟等）的具有修復和再生能力的干細胞，在特定條件下，成體干細胞產生新的干細胞或按一定的程序化形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態平衡，與胚胎干細胞不同的是，成體干細胞只可以向其定居的組織類型分化。干細胞是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫學界稱為“萬用細胞”。睪丸里的生殖干細胞，是睪丸中所有精細胞和內分泌細胞的母親細胞、種子細胞。睪丸里的生殖干細胞在男性和雄性動物的生命進程中，是一個進行性和累計性的消耗過程。生殖干細胞的消耗殆盡時，睪丸老化，喪失生精和排精功能，荷爾蒙降低，男性和雄性動物進入老年。因此，生殖干細胞的消耗，睪丸功能枯渴，睪丸衰老與男性和雄性動物的整體衰老及壽命的長短有密切關聯。?

現在國際上主要采用兩種方法制備生殖干細胞。一種方法是通過自然的胚胎干細胞體外分化形成異體生殖細胞，應用于研究領域，；第二種方法是從睪丸或卵巢分離培養制備自體生殖干細胞，應用不孕不育的治療領域，分離培養耗時困難，生殖細胞來源困難，獲取數量極其稀少。?

應用自體生殖干細胞移植，進行衰老睪丸的再生和再造，是延緩睪丸衰老，恢復和提升機體各種機能和延長壽命的有效方法。但是，如何獲得足夠數量、安全性低的男性和雄性動物自體生殖干細胞，是一個有待研發的醫學生物學難題。?

發明內容

針對現有技術中獲取的男性和雄性動物自體生殖干細胞數量少、安全性低的問題，本發明提供了一種制備雄性非睪丸源性蛋白誘導性自體生殖干細胞的方法，該方法包括：?

將體細胞以5×10⁶的密度接種于細胞培養皿中。體細胞包括但不限于雄性動物的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、脂肪細胞等。?

在37℃和5%的CO₂的環境中，將體細胞或單個核細胞在細胞培養液A（RPMI?1640培養液）中培養1-3天。培養液A中含有：?

1-100μM的RHO激酶抑制劑Y-27632（C₁₄H₂₁N₃O.2HCl），優選值為10μM；?

1-100ng/ml的干細胞因子，優選值為10ng/ml；?

1-100ng/ml的白細胞介素3，優選值為10ng/ml；?

1-100ng/ml的白細胞介素6，優選值為10ng/ml；?

1-100ng/ml的白細胞介素11，優選值為10ng/ml；?

1-100ng/ml的巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF），優選值為10ng/ml；?

1-100ng/ml的粒細胞集落刺激因子（G-CSF），優選值為10ng/ml；?

1-100μg/ml的巖藻多糖，優選值為10μg/ml；?

1-100μg/ml的葡聚糖硫酸酯，優選值為10μg/ml；?

1-100nM的AMD?3100（1,1′-[1,4-亞苯基二(亞甲基)]-二-1,4,8,11），優選值為10nM；?

1-100μM的M-阿侖膦酸鈉（M-ALENDRONATE?SODIUM?TRIHYDRATE），優選值為10μM；以及?

1-100μM的氨羥二磷酸二鈉，優選值為10μM。?

在37℃和5%的CO₂的環境中，將體細胞或單個核細胞在細胞培養液B?（DMEM培養液）中培養1-6天。培養液B中含有：?

1-100μM的RHO激酶抑制劑Y-27632（C₁₄H₂₁N₃O·2HCl），優選值為10μM；?

1-100μM的1-磷酸-神經鞘氨醇，優選值為10μM；?

1-100μg/ml的骨形態發生蛋白2（BMP-2），優選值為10μg/ml；?