[發明專利]一種水霉菌絲的提取方法

無效

• 申請號: 201310361168.0
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103468584A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 胡鯤;葉鑫;趙依妮;袁海蘭;楊先樂
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 曹翠娟

【技術領域】

本發明涉及微生物技術領域，具體地說，是一種關于菌絲的提取方法。

【背景技術】

水霉科是一類水生真菌，廣泛分布于淡水中，幾乎感染所有的淡水魚類和粘性魚卵，對養殖業造成了巨大的經濟損失。目前國內外對于水霉菌的研究主要集中在水霉病的癥狀描述，病原菌的鑒定，致病條件的探討，防治方法的摸索以及一些分子水平方面的研究，而在分子實驗中水霉菌絲樣品的制備很是重要。因此，在開展分子實驗時，最基本步驟需獲得純水霉菌絲，一種有效、簡單的樣品制備方法會使的研究工作更加順利，研究成果更加可靠。為此特發明了一種水霉菌絲高效簡易的提取方法。

中國專利文獻CN1090717公開了一種人參真菌及其提取物的制備方法及人參真菌提取物用途。中國專利文獻CN1075654公開了一種人含茯苓菌絲或其提取物的制劑及其制備方法。但是關于提取水霉菌絲的簡易方法的專利目前還未見報道。?

【發明內容】

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種適用于水霉菌絲的高效提取方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：?

（1）水霉菌的提取：????1）孢子懸液的制備

將水霉菌（寄生水霉和多子水霉）接種于放有無菌油菜籽的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，于?20?℃?恒溫條件下培養直至油菜籽上長滿菌絲；在六孔板中加入無菌水，將長滿菌絲的油菜籽放入六孔板中；然后于?20?℃?恒溫培養箱中培養，24小時后于顯微鏡下觀察水霉菌絲孢子的釋放情況，當孢子數量達到一定量以后，再將菜籽取出。

2）水霉菌絲的提取?

在六孔板中加入沙氏葡萄糖液體培養基，置于?20?℃?恒溫條件下培養直至長出菌絲；然后用無菌的鑷子夾出菌絲，于無菌水中漂洗?3?~?4次，用無菌的濾紙吸取菌絲上的水，即為水霉菌絲。?

3）對照組實驗比較?

對照組以PDA培養基培養菌絲，待菌絲長滿平板時，即用鑷子將培養基表面的菌絲夾取下來，先用生理鹽水漂洗一次，然后再用無菌水清洗。

本發明優點在于：?

1、菌絲更易獲得。

2、菌絲量更多。單位位時間內沙氏葡萄糖液體培養基上獲得兩種水霉菌絲的重量是PDA固體培養基的?3?~?4?倍?

3、操作更簡易。獲取相同重量的兩種水霉菌絲在沙氏葡萄糖液體培養基上用的時間是是PDA固體培養基的?1/8?~?1/7?倍

【具體實施方式】

下面對本發明提供的具體實施方式作詳細說明。

一、材料和方法

1.1?實驗材料

寄生水霉ATCC200013TM，購于美國標準生物品收藏中心；多子水霉（將發病魚或魚卵用?75%?酒精浸洗?3?次,?然后用無菌蒸餾水沖洗?6?次,?置于加有?100?mg/L?鏈霉素青霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)平板上,?在?20?°C?恒溫培養?24?h后立即在長出的菌落邊緣放置無菌油菜籽,?在?20?°C恒溫繼續培養,待油菜籽上覆蓋菌絲后將其取出并置于滅菌過濾河水中,?于?20?°C?培養直至游動孢子釋放。無菌吸取?100?μL?孢子懸液至?PDA?平板上均勻涂布,?20?°C?恒溫培養并切取單菌落瓊脂塊到?PDA平板上進行純化培養,?于?4°C?保存待用），沙氏葡萄糖液體培養基、馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養基平板、無菌蒸餾水、六孔板、1mL?槍頭，購于國藥集團（上海）化學試劑有限公司；油菜籽粒，購于上海市古棕路菜市場；-?80?℃?恒溫冰箱、生化培養箱，購于日本三洋公司；Ph?=?5.6的沙氏葡萄糖液體培養基、鑷子、油菜籽粒、濾紙、1?mL槍頭在?1?x?10⁵Pa?高壓濕熱滅菌?20?min?后備用。

實施例?1

2、實驗具體步驟

水霉菌的提取

2.1孢子懸液的制備

將水霉菌（寄生水霉和多子水霉）接種于放有無菌油菜籽的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基平板上，于?20?℃?恒溫條件下培養直至油菜籽上長滿菌絲；在六孔板中加入無菌水，將長滿菌絲的油菜籽放入六孔板中；然后于?20?℃?恒溫條件下培養箱中培養，36小時后于顯微鏡下觀察水霉菌絲孢子的釋放情況，當孢子數量達到一定量以后，再將菜籽取出。

2.2水霉菌絲的提取?