[發明專利]含有遺傳毒性生物傳感器的酵母單基因缺失文庫

有效

• 申請號: 201310360655.5
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103510161A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 戴和平;蕭偉;魏婷;湯花梅;張超;許鑫;袁麗;張曉華
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C40B40/02
• 分類號: C40B40/02;C40B50/06;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司 42215
• 代理人: 王健

技術領域

本發明涉及生物技術，尤其涉及經過遺傳基因改造的微生物對遺傳毒性化合物的檢測。

背景技術

釀酒酵母是一種簡單真核生物，單細胞，遺傳改造操作簡單，培養簡便快速且環境友好，適合作為一種模式生物應用于生命科學研究。1996年釀酒酵母全基因組序列分析作為第一個真核生物全基因組序列信息被公布，約有5800個基因序列信息被獲得而其中大約有23%基因與人類同源，因此釀酒酵母作為一種簡單的模式生物因其已知的全基因組序列信息可為深入研究真核生物乃至高等生物生命機制提供基礎。

基于已知的釀酒酵母全基因組序列，斯坦福大學研究人員為主的多個實驗室構建得到釀酒酵母單基因缺失株文庫（Saccharomyces?Genome?Deletion?Project）（Giaever?et?al.,Functional?profiling?of?the?Saccharomyces?cerevisiaegenome,2002,Nature418(6896):387-391.），該文庫以野生型釀酒酵母菌株作為背景菌株，利用以PCR為基礎的基因敲除策略（PCR-based?gene?deletion?strategy），根據基因同源重組原理逐個對釀酒酵母基因組中的每一個基因進行敲除，最后共得到5396個分別單基因敲除的突變株。由PCR介導的基因敲除策略，即將酵母基因組中每個基因的開放閱讀框（ORF）被卡那霉素抗性基因（KanMX）同源重組置換，并利用G418抗性對基因敲除菌進行篩選。PCR擴增KanMX基因所用到的引物由四部分組成，其中包括（1）酵母目的基因ORF片段前18bp同源序列；（2）18bp通用引物U1、D1；（3）一段20bp長度的僅標示、鑒定目的缺失基因的特異條形碼序列（barcoding?sequence），即每一個酵母基因都對應一條特異性條形碼序列；（4）18bp與KanMX基因同源的序列。

目前該文庫的應用主要是建立一種合成致死篩選微陣列（Synthetic?genetic?array,SGA）方法即通過檢測細胞生長速率和致死性來研究酵母中基因功能及分子機制（Baryshnikova?et?al,Synthetic?Genetic?Array(SGA)Analysis?in?Saccharomyces?Cerevisiae?and?Schizosaccharomyces?Pombe,2010,Meth?ods?in?Enzymology,Vol470:Guide?to?Yeast?Genetics:470:145-179.）并應用于一些化合物毒性的分析。而Boone等人利用SGA手段已繪制了釀酒酵母全基因組范圍內的雙基因缺失遺傳相互作用圖譜（Boone?et?al.,The?genetic?landscape?of?a?cell,2010,Febs?Journal277:7-8.），其中可定量分析基因間相互作用的基因占全基因組的75%，為釀酒酵母遺傳相互作用的研究提供了一個高通量、覆蓋面全、意義重大的有力工具。但是這種以致死性為檢測指標的分析，限制了對一些化合物的非致死性生物毒性的檢測和分析，比如一些遺傳毒性化合物，它們可能不會致死，但具有DNA損傷效應。如果將DNA損傷響應的生物傳感器轉入到酵母單基因缺失文庫中，將會擴展文庫的應用范圍，開展高通量、特異性遺傳毒性化合物易感基因群的篩選。

基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器是一種用于檢測環境遺傳毒性化合物的檢測系統，該類型生物傳感器的構建需具備以下兩個基本元件：感應元件和連接于此后的效應元件。前者利用其自身功能可對DNA損傷進行響應，并開啟后者的表達，從而產生可檢測出的信號。基于酵母DNA損傷響應的生物傳感器RNR3-yEGFP（專利申請號201210269407.5）、酵母靈敏型遺傳毒性致癌物檢測系統HUG1-yEGFP（專利申請號201210263302.9）即分別利用RNR3、HUG1兩種基于DNA損傷轉錄應答的基因啟動子作為生物傳感器的感應元件，yEGFP酵母增強型綠色熒光蛋白作為效應元件構建而成，這兩種生物傳感器可檢測多種遺傳毒性致癌物，可應用于高通量的遺傳毒性致癌物環境實時現場監測。