[發(fā)明專利]鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性DNA序列、引物、鑒定方法及鑒定試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310360552.9
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103409536A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張宇宏;龐虹;余彥瑩;毛潤乾;鄭基煥
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省昆蟲研究所;中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于應用生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性DNA序列、引物、鑒定方法及鑒定試劑盒。

背景技術(shù)

孟氏隱唇瓢蟲（Cryptolaemus?montrouzieri?Mulsant）屬鞘翅目、瓢蟲科，原產(chǎn)于澳大利亞，是粉蚧類害蟲重要的捕食性天敵。孟氏隱唇瓢蟲可以捕食20多種蚧蟲，且在我國東南沿海、東南亞以及大部分熱帶、亞熱帶地區(qū)均有分布。在我國、埃及、印度等地，研究人員進行過多次孟氏隱唇瓢蟲的行為及應用于生物防治的試驗，都證明該瓢蟲是種開發(fā)前景廣闊的天敵昆蟲。由于其具有食性專一、食量大、易于室內(nèi)飼養(yǎng)等諸多優(yōu)良特性，被越來越廣泛的應用于粉蚧的生物防治。然而，孟氏隱唇瓢蟲幼蟲的蟲體完全被白色蠟質(zhì)覆蓋，和粉蚧類害蟲非常相似，在粉蚧害蟲聚集的地方，很難分辨是否存在捕食性的孟氏隱唇瓢蟲；另外，全世界已記錄的瓢蟲種類已經(jīng)超過5000種，根據(jù)其食性又可分為植食性、菌食性、捕食性三大類，其中，只有作為害蟲天敵的捕食性瓢蟲是利用和保護的對象，而瓢蟲中一些近源種通過形態(tài)鑒定很難區(qū)分，就必須要解剖生殖器，這就對采集標本的完整性有很高要求，并且鑒定耗時耗力。近年來，利用分子生物學技術(shù)進行物種鑒定已經(jīng)在珍惜物種及檢驗檢疫方面得到了應用，但在天敵瓢蟲的鑒定方面還沒有報道。因此，研究建立一種高效、快速、靈敏且準確度高的孟氏隱唇瓢蟲鑒定方法就十分必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個目的是提供從孟氏隱唇瓢蟲基因序列中克隆的，能用于鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性DNA序列。

本發(fā)明根據(jù)孟氏隱唇瓢蟲EST序列設(shè)計COI基因的特異性引物并進行PCR擴增，獲得449bp的DNA特異性條帶，對其回收、克隆、測序后進行同源性比較，確定該特異性DNA序列可作為鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性DNA序列，用于區(qū)分該物種與近緣的天敵瓢蟲及形態(tài)上不易分辨的昆蟲成蟲及幼蟲，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性DNA序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的提供一對能鑒定孟氏隱唇瓢蟲的特異性PCR引物，其特征在于，包括正向引物：TAATGTTATTGTAACTGCCCATG（如SEQ?ID?NO.2所示）和反向引物：CAGCTAAAACAGGTAAGGAAAG（如SEQ?ID?NO.3所示）。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種能特異性鑒定孟氏隱唇瓢蟲的試劑盒，包括DNA提取試劑、PCR反應試劑和引物，其特征在于，所述的引物為正向引物：TAATGTTATTGTAACTGCCCATG和反向引物：CAGCTAAAACAGGTAAGGAAAG。

用此引物擴增田間采集的害蟲的基因組DNA樣本，如有449bp擴增條帶，則為混合有孟氏隱唇瓢蟲物種的樣本。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒定孟氏隱唇瓢蟲的方法，其特征在于，以正向引物：TAATGTTATTGTAACTGCCCATG和反向引物：CAGCTAAAACAGGTAAGGAAAG作為PCR引物通過PCR方法對基因組DNA樣本進行擴增，如有449bp擴增條帶，則為混合有孟氏隱唇瓢蟲物種的樣本。

本發(fā)明克服了傳統(tǒng)瓢蟲分類對標本完整性要求高、需要專業(yè)分類專家、鑒定成本高等問題，提供的PCR引物及鑒定方法不僅能提高孟氏隱唇瓢蟲鑒定的效率和準確性，而且操作簡便快捷，適合于田間檢測粉蚧類害蟲種群中是否混有捕食性的孟氏隱唇瓢蟲，對室內(nèi)養(yǎng)殖過程進行質(zhì)量監(jiān)控、對孟氏隱唇瓢蟲的生防效果進行準確評估等方面，具有重要的理論意義和應用價值。

附圖說明

圖1為用設(shè)計的PCR引物對18種昆蟲DNA樣本進行PCR檢測的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；