[發明專利]檢測克羅諾桿菌的引物對、探針和方法有效

申請號：	201310359507.1	申請日：	2013-08-16
公開（公告）號：	CN103409535A	公開（公告）日：	2013-11-27
發明（設計）人：	陳穎;王娉;胡玥;田雪;楊海榮;趙勇勝;趙貴明;劉洋	申請（專利權）人：	中國檢驗檢疫科學研究院
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
代理公司：	隆天國際知識產權代理有限公司 72003	代理人：	王芝艷;吳小瑛
地址：	100123 ***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	檢測克羅諾桿菌引物探針方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體而言，本發明涉及用于高特異、高靈敏度的快速檢測克羅諾桿菌屬細菌的寡核苷酸引物對和探針以及包含所述引物對和探針的試劑盒，高特異、高靈敏度的快速檢測克羅諾桿菌屬細菌的實時熒光PCR方法，以及所述引物對和探針或試劑盒在快速檢測克羅諾桿菌屬細菌中的應用。

背景技術

克羅諾菌屬(Cronobacter?spp.)細菌曾經一直被稱為產黃色素的陰溝腸桿菌，1980年被定義為阪崎腸桿菌。2008年Iversen等根據16S?rRNA基因序列、DNA-DNA雜交試驗、熒光擴增片段長度多態性等對阪崎腸桿菌進行了新的系統學分類，建議將該菌定義為一個新的屬，即克羅諾桿菌屬。該屬包括5個新種和3個新亞種及1個克羅諾桿菌基因種。目前，阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter?sakazakii)是克羅諾桿菌屬中研究較多的一種，它是一種條件致病菌，廣泛存在于自然界，能引起嚴重的新生兒腦膜炎、壞死性結腸炎和菌血癥，死亡率高達50%以上。FAO和WHO認為克羅諾桿菌屬所有的種都是致病的。目前，研究者們尚不清楚克羅諾桿菌的污染來源，但多數病例報告表明嬰幼兒配方粉是克羅諾桿菌污染的主要渠道。

傳統的克羅諾桿菌的檢測方法主要依賴于生化和形態學特點，國際上通常以美國FDA頒布的“嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的分離計數”作為經典方法。傳統檢測方法操作繁瑣、耗時較長且準確性和靈敏度較低。隨著分子生物技術的發展，PCR、熒光PCR等技術在食源性致病菌的檢測中廣泛應用。針對阪崎克羅諾桿菌的不同靶基因，研究者們也開展了克羅諾桿菌的實時PCR檢測研究，但熒光定量PCR檢測主要還是針對阪崎克羅諾桿菌的檢測。我國于2005年10月起將阪崎克羅諾桿菌列為進出口乳及乳制品的必檢項目。隨著阪崎腸桿菌分類學地位的變化，為保護消費者的健康及乳粉的安全，建立快速、靈敏且特異的克羅諾桿菌屬細菌的檢測方法顯得尤為必要。

聚合酶鏈式反應(PCR)是通過擴增待測樣品的DNA，使其能夠從最初的微小數量增至足以達到檢測限量的巨大數量。PCR方法已用于多種多樣的基因檢測中。實時熒光PCR是在PCR反應體系中加入熒光報告基團，利用熒光信號來實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板濃度進行定量分析，使PCR技術從定性水平發展到定量水平。近幾年，在分子生物學研究中，利用定量PCR對基因表達結果進行檢測，獲得了應用。由于其大大提高了檢測的靈敏度、特異性和精確性并能有效地減少實驗過程中產生污染的危險，目前已廣泛應用于各個領域。

目前，國內外少見報道能同時快速、特異、靈敏的檢測食品中克羅諾桿菌屬細菌的實時熒光PCR方法。

因此，本領域亟需建立一種方便快速、特異性好、靈敏度高的克羅諾桿菌屬細菌檢測方法，用于克羅諾桿菌的定性及定量檢測。

發明內容

一方面，本發明提供了用于通過實時熒光PCR方法檢測克羅諾桿菌屬細菌的寡核苷酸引物及探針。

本發明以克羅諾桿菌DNA為基礎，根據阪崎克羅諾桿菌葡萄糖苷酶基因(EF635114.1)中保守性強的區域，設計針對克羅諾桿菌屬所有種細菌的特異性引物對及探針，利用實時熒光PCR方法快速檢測克羅諾桿菌屬細菌。

本發明可用于檢測多種樣品(例如食品)中的羅諾桿菌屬細菌。

在一個實施方案中，本發明提供用于通過實時熒光PCR方法檢測克羅諾桿菌屬細菌的寡核苷酸引物對及探針，所述引物對及探針是根據阪崎克羅諾桿菌葡萄糖苷酶基因(EF635114.1)中保守性強的區域而設計的。

在一個實施方案中，所使用的引物對序列為：

CroF：5’-TGTGGACGACATCTGCCG-3’(SEQ?ID?NO.1)；

CroR：5’-TTCTCCCCCACCCACTCTT-3’(SEQ?ID?NO.2)；

探針序列為：

CroP：5’-GTCTACGACATGATGCGCTG-3’(SEQ?ID?NO.3)。