[發(fā)明專利]一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310358330.3
• 申請日: 2013-08-17
• 公開（公告）號: CN103468798A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設計）人: 馬正;俞曉平;曹偉;侯云;邊亞琳;郝培應;許益鵬;申屠旭萍;王正亮
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術領域

本發(fā)明通過結合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術對褐飛虱不同齡期時多種類酵母共生菌群落結構的變化規(guī)律進行研究，屬于基因工程技術領域。

背景技術

褐飛虱屬于同翅目飛虱科，是危害東南亞國家和我國南方稻區(qū)最嚴重的水稻害蟲之一，對農(nóng)作物的危害除刺吸汁液和產(chǎn)卵危害外，還傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病、小麥叢矮病和玉米粗縮病等病毒病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失，因此急需一種經(jīng)濟、有效和環(huán)保的方式來遏制褐飛虱的發(fā)生和危害。

同其他同翅目昆蟲一樣，褐飛虱體內(nèi)存在共生菌，類酵母共生菌(Yeast-like?Symbiotes，YLS)是飛虱體內(nèi)的優(yōu)勢菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪體和卵中，并隨卵垂直傳遞給下一代。YLS還參與氮素循環(huán)，為寄主提供氨基酸、固醇類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，并對稻飛虱生長、發(fā)育、繁殖、致害性變化等起到重要作用。經(jīng)過高溫或抗生素減菌處理后，發(fā)現(xiàn)缺共生菌的飛虱若蟲的齡期明顯比正常若蟲長，且存活率也比正常若蟲低。隨著褐飛虱若蟲的生長發(fā)育，褐飛虱體內(nèi)共生菌的數(shù)量也隨之增加。這些結果表明類酵母共生菌與飛虱的生長發(fā)育息息相關，因此明確褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌具體的變化規(guī)律具有十分重要的意義。

然而，褐飛虱體內(nèi)的類酵母共生菌生存環(huán)境較為特殊，因此難以進行離體培養(yǎng)。傳統(tǒng)研究主要基于顯微法觀察褐飛虱不同生長發(fā)育期類酵母共生菌的變化，但這種方法效率低且準確性差。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種褐飛虱不同齡期體內(nèi)類酵母共生菌檢測方法。

褐飛虱是一種農(nóng)業(yè)害蟲，研究發(fā)現(xiàn)其生長發(fā)育和體內(nèi)的類酵母共生菌有密切的聯(lián)系，明確褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的變化規(guī)律具有十分重要的意義。尚未見有關利用分子生物學技術分析褐飛虱不同齡期類酵母共生菌的研究報道。

本發(fā)明首先收集不同齡期的褐飛虱作為研究對象，利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing?Gradient?Gel?Electrophoresis,?DGGE)技術和實時熒光定量PCR?(Real-time?Quantification?PCR,?qPCR)技術，特定地研究三種類酵母共生菌：Noda菌（Hypomyces?chrysospermus），季也蒙畢赤酵母(Pichia?guilliermondii)，假絲酵母(Candida?quercitrusa)在褐飛虱不同蟲齡之間的變化規(guī)律。

所述的類酵母共生菌為Noda菌（Hypomyces?chrysospermus），季也蒙畢赤酵母(Pichia?guilliermondii)，假絲酵母(Candida?quercitrusa)。

所述的褐飛虱不同發(fā)育時期為1，2齡、3齡、4齡、5齡以及剛羽化雌成蟲。

所述的檢測不同齡期三種類酵母共生菌的方法過程如下：

1）褐飛虱脂肪體中的類酵母共生菌進行分離純化，并提取基因組，以上述提取的基因組為模板；

2）根據(jù)三種菌株的18SrDNA的特征序列設計引物進行PCR擴增；

3）利用變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術對多種菌株的變化規(guī)律定量分析。

利用DGGE和qPCR結合技術揭示了三種菌在褐飛虱不同齡期呈現(xiàn)相近的變化規(guī)律。在4齡若蟲期之前，不同共生菌的數(shù)量均隨著蟲齡的增加而增加，5齡若蟲期數(shù)量有顯著的下降趨勢，而到成蟲期數(shù)量又有顯著地回升。其中Hypomyces?chrysospermus菌的數(shù)量在這三種共生菌中占有絕對優(yōu)勢。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明利用DGGE和qPCR技術檢測了褐飛虱不同齡期多種類酵母共生菌的變化規(guī)律，為今后研究類酵母共生菌與褐飛虱生長發(fā)育之間的聯(lián)系提供了有效的工具。

附圖說明

圖1?是三種菌在不同齡期的變性梯度凝膠電泳圖；A:?Hypomyces?chrysospermus，B:?Pichia?guilliermondii，C:?Candida?quercitrusa。

圖2A是Hypomyces?chrysospermus質(zhì)粒標準品的標準曲線圖。

圖2B是Pichia?guilliermondii質(zhì)粒標準品的標準曲線圖。

圖2C是Candida?quercitrusa質(zhì)粒標準品的標準曲線圖。