[發明專利]用于漢灘病毒感染后快速檢測與鑒定的SYBR GreenⅠReal-time PCR方法

有效

• 申請號: 201310357737.4
• 申請日: 2013-08-16
• 公開（公告）號: CN103436637A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 吳興安;劉梓諭;王芳;張曉曉;張芳琳;程林峰;袁利娟;徐志凱
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 西安吉盛專利代理有限責任公司 61108
• 代理人: 邱志賢

技術領域

本發明屬于病毒檢測領域，涉及分子生物學、病毒學、免疫學及免疫應用等相關領域。本發明具體涉及一種用于漢灘病毒感染后快速檢測與鑒定的SYBR?GreenⅠReal-time?PCR方法。檢測與鑒定漢灘病毒核酸的樣本包括感染Vero?E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者。它包括設計一對特異性擴增漢灘病毒的引物，通過制備標準品，研究和優化實驗條件，對提取感染Vero?E6細胞、感染實驗小鼠和臨床患者血清的總RNA進行qRT-PCR特異性擴增檢測。

背景技術

腎綜合征出血熱診斷與檢測研究現狀：

漢灘病毒屬于布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是一種分節段的負鏈RNA病毒,?基因組由大（L）、中（M）、小（S）三個基因片段組成，分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、糖蛋白Gn和Gc和核衣殼蛋白。目前漢坦病毒屬在世界范圍內存在30個基因型，我國以漢灘（HTNV）和漢城（SEOV）型為主。漢坦病毒屬病毒感染人主要可以引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagic?fever?with?renal?syndrome，HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus?pulmonary?syndrome，HPS），在我國主要引起以發熱、出血和急性腎功能損害為特征的腎綜合征出血熱。該病是我國最為常見的自然疫源性疾病之一，危害十分嚴重。此外，漢灘病毒還是一種可被侵略者和恐怖分子所利用的生物戰劑，已被列入國際《禁止生物武器公約》議定書核查清單，因此具有極其重要的意義。目前對該病毒所致疾病仍無特效的治療藥物，因此及時發現和診斷漢灘病毒感染顯得尤為重要。早期診斷是控制病情，提高治愈率，避免臨床誤診貽誤治療時機的關鍵。

實時定量PCR技術是從傳統PCR技術發展而來，其基本原理是相同的，主要不同之處是其定量體系。在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光基團，這些熒光物質有其特定的波長，儀器可以自動檢出，利用熒光信號積累，實時監測整個PCR進程，最終對初始模板進行定量。傳統的PCR定量是一種終點法的檢測，動態范圍受限且檢測重現性極差。實時定量PCR依靠熒光信號的擴增進行檢測，具有靈敏度高，重復性好，動態范圍寬，高通量等優點。實時熒光定量PCR技術主要分為熒光染料法和熒光探針法兩種。

SYBR?green?I是一種能與dsDNA特異結合的染料，在PCR反應體系中，加入過量SYBR?green?I熒光染料，可特異性地與dsDNA結合，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號。從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本，因此非常適合大規模樣本的檢測。

Taqman探針法是通過寡聚核苷酸探針與目的序列互補實現的。探針的5′端標記熒光報告基團，3′端標記熒光淬滅基團，當兩個基團相互靠近的時候，由于發生能量傳遞作用，報告基團不能發出熒光，但隨著擴增反應的進行，5′端的報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅基團發生能量傳遞作用，從而能發出熒光，被信號探測器所捕獲，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。因為只有引物和探針都和同一模板結合時才能檢測，同時可以在一次反應中同時檢測多個不同目的基因序列，因此探針法具有特異性高，可多通道檢測的特點，但價格昂貴，不適合做大規模樣本的檢測。

對于漢灘病毒感染，目前常用的診斷方法主要是傳統的免疫學方法，包括病毒的分離鑒定、ELISA法檢測血清中抗HTNV?IgM、IgG抗體、間接免疫熒光法（IFA法）檢測病毒抗原和抗體以及核酸分子雜交檢測病毒基因組等。但經典的分離鑒定法費時，IFA法也不適用于快速的現場檢測，檢測HTNV抗體僅是一個側面的間接指標，且均存在著特異性和敏感性不夠高、不能準確定量等問題。實時熒光定量PCR（Real-time?fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction，Real-time?PCR）以其特異性強、靈敏度高、檢測速度快、能準確定量等優點，逐漸成為分子生物學和醫學研究等領域的重要工具，在病原的定性定量檢測、基因表達水平分析等方面得到了廣泛應用。

發明內容