[發明專利]一種抗體效價的檢測方法

有效

• 申請號: 201310354934.0
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103439515A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 裘宇容;付琳;姜云飛
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C07K17/08
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明涉及一種抗體效價的檢測方法，特別涉及利用改性固相載體檢測抗體效價的方法。

背景技術

抗體效價是疾病診斷、特異性免疫球蛋白制備和疫苗評價等領域的重要指標，對其檢測具有非常實際的意義。在眾多的抗體效價測定技術中，ELISA法因為操作簡單，速度快，應用最為廣泛。

類風濕性關節炎(rheumatoid?arthritis，?RA)是一種累及周圍關節為主的慢性多系統性炎癥性的自身免疫病，特征性的臨床表現為多個周圍關節慢性炎癥性病變，可造成永久性的關節畸形，致殘率高，被稱為“不死的癌癥”。因此早期診斷、早期治療，可延緩病情進展，降低致殘率，改善預后。

環瓜氨酸肽（cyclic?citrullinated?peptide，CCP）是一條人工合成的含有21個氨基酸的多肽，其氨基酸序列為HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，其中X代表瓜氨酸，其通過第3和第16位的半胱氨酸巰基氧化而形成環肽。瓜氨酸殘基是類風濕關節炎特異的抗中間絲相關蛋白（filaggrin）抗體識別表位的必需組成部分。抗環瓜氨酸肽抗體（anti-cyclic?citrullinated?peptide?antibody，anti-CCP）是環狀聚絲蛋白的多肽片段，是以IgG型為主的抗體，對類風濕性關節炎（RA）具有很好的敏感性和特異性，且抗CCP抗體陽性的RA病人骨破壞較抗CCP抗體陰性者嚴重。2010年由美國風濕病學會（ACR）和歐洲抗風濕聯盟（EULAR）一起宣布新的RA分類診斷標準，抗CCP?抗體被正式列入類風濕性關節炎的診斷標準之中。

目前，抗CCP?抗體的檢測ELISA?法應用最廣泛。其他檢測方法多處于初步的摸索研究階段，由于檢測儀器設備、試劑價格等方面的限制，檢測方法仍不成熟，影響檢測及診斷性能的因素仍需進一步改進。然而，現有的ELISA法的檢測時間還是過長，一般需要2個小時才可以獲得結果。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抗體效價的檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

一種抗體效價的檢測方法，包括如下步驟：

1)??????將抗原偶聯微球上，得到改性微球；

2)??????將改性微球與抗體溶液混合反應；

3)??????測定反應液的濁度，確定抗體效價。

一種抗CCP抗體效價的檢測方法，包括如下步驟：

1)??????在CCP多肽上偶聯特異性親和小分子，在微球上偶聯特異性親和小分子的特異性靶標分子；

2)??????將修飾后的CCP多肽和微球混合，得到顆粒型CCP多肽抗原；

3)??????將顆粒型CCP多肽抗原與抗體溶液混合，反應；

4)??????測定反應體系的濁度，確定抗體效價。

作為本發明的進一步改進，CCP多肽上偶聯的特異性親和小分子為生物素，微球上偶聯的特異性靶標分子為鏈霉親和素。

在CCP多肽偶聯生物素包括如下步驟：

1)??????將CCP多肽溶解于緩沖液中，酯化生物素用二甲基亞砜溶解，混合；

2)??????室溫攪拌反應完全，去除未反應的生物素；

3)??????收集、純化得到偶聯生物素的CCP多肽。

在微球上偶聯鏈霉親和素包括如下步驟：

1)??????將羧基化膠乳微球與乙磺酸緩沖液混合，加入EDC和NHS活化，洗滌得到活化微球；

2)??????將鏈霉親和素溶解于PBS緩沖液中，加入活化微球，室溫反應，反應完全后洗滌；

3)??????用賴氨酸封閉，得到SA修飾微球。

特別的，上述在微球上偶聯鏈霉親和素的反應中，鏈霉親和素溶解于pH6.8～7.8的PBS緩沖液中。

更進一步的，EDC和NHS的摩爾比為1：（1～2）。

本發明的有益效果是：

本發明的方法，利用生物素-鏈霉親和素系統將CCP修飾在聚苯乙烯微球表面成功制備顆粒型CCP抗原；采用本方法制備的顆粒型CCP抗原檢測血清中抗CCP抗體效價，檢測結果線性良好，檢測過程20min即可完成，相對于現有ELISA檢測方法需耗時2～3h，可以更為快捷的獲得檢測結果。

本發明CCP多肽的生物素標記方法，反應條件溫和，不會破壞CCP多肽的活性，具有很好的反應活性。

附圖說明

圖1為生物素修飾CCP結構示意圖；

圖2為驗證生物素修飾CCP效果操作流程圖；