[發明專利]蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3AfAa及其編碼基因和應用

無效

• 申請號: 201310354718.6
• 申請日: 2013-08-15
• 公開（公告）號: CN103421099A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 潘剛;趙晨晨;楊茜;程方民
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/325
• 分類號: C07K14/325;C12N15/32;C12N15/63;A01H5/00;A01N47/44;A01P7/04
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及生物防治技術領域，具體涉及蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3AfAa及其編碼基因和應用。

背景技術

農作物病蟲害是我國的主要農業災害之一，它具有種類多、影響大、并時常暴發成災的特點，其發生范圍和嚴重程度對我國國民經濟、特別是農業生產常造成重大損失。據統計，我國每年因病蟲害損失糧食近500億斤、各類經濟作物1800萬噸。過去為了防治作物的各種蟲害，化學農藥被廣泛使用，然而，一方面由于長期大量使用農藥，導致部分昆蟲產生了一定的耐藥性或抗性，致使農藥的使用劑量在逐年增加或使用全新的農藥；另一方面，由于長期過度使用化學農藥，導致人類賴以生存的環境受到不同程度污染。因此，需要尋找更好的途徑防控各種病蟲害。隨著生物技術的發展，利用抗蟲基因培育抗蟲轉基因植物是一條行之有效的途徑。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis，Bt）是植物外源抗蟲基因的重要供體菌，其毒性活性主要源自芽胞形成時所產生的伴孢晶體毒素，即殺蟲晶體蛋白（insecticidal?crystalline?protein，ICP），包括晶體毒素（crystalline?toxin，Cry）和細胞裂解毒素（cytolytic?toxin，Cyt）。ICP是由Cry基因和Cyt基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。

已報道的殺蟲晶體蛋白基因有748種，很多已廣泛應用于抗蟲轉基因育種中。然而，由于大部分商業化利用的轉基因作物均為殺蟲晶體蛋白類，隨著這些轉基因作物種植面積的擴大，害蟲對單一的殺蟲蛋白產生抗性已成為一個嚴峻的問題。因此尋找新的抗蟲基因顯得尤為重要。

科學家經過不懈的努力，從一些營養生長時期的Bt菌株中分離得到具有殺蟲毒性的非伴孢晶體殺蟲蛋白，合成后即被分泌到胞外，這就是被稱為第二代抗蟲蛋白的蘇云金芽胞桿菌的營養期殺蟲蛋白（vegetative?insecticidal?protein，Vip）。Vips主要分為Vip1、Vip2、Vip3和Vip4四種類型共108個殺蟲蛋白，其中77個蛋白屬于Vip3。Vip3的殺蟲譜和殺蟲活性與ICPs不同，前者對鱗翅目、鞘翅目和同翅目等害蟲具有毒殺作用，且抗蟲譜更廣。目前，這些基因被廣泛應用于抗蟲轉基因水稻、玉米和棉花育種。

然而，Vip3基因的資源畢竟是有限的，而且不同的基因間的抗性存在比較大的差異，同時細菌的基因是富含AT的，這勢必影響基因在植物中的表達，對相應基因進行人工改造，可以進一步提高基因的利用效率。

文獻（Fang?et?al.,Characterization?of?chimeric?Bacillus?thuringiensis?Vip3toxins,Applied?and?Environmental?Microbiology,2007,73(3):956-961；方軍，蘇云金桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3基因及其在轉基因水稻中的應用，2008，博士論文，浙江大學圖書館）通過將Vip3Ab2的N端或C端與Vip3Aa1的C端或N端嵌合，人工合成Vip3AbAa和Vip3AaAb，結果表明，嵌合基因的殺蟲譜更廣，而且對部分昆蟲的殺蟲活性更高。因此，通過人工合成嵌合基因是改造Vip3基因的有效途徑。

發明內容

本發明提供了一種蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3AfAa，該蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白能在植物細胞中高效表達，對鱗翅目、鞘翅目和同翅目等昆蟲具有較高的殺蟲活性。

一種蘇云金芽孢桿菌（Bacillus?thuringiensis）營養期殺蟲蛋白Vip3AaBb，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發明還提供了所述蘇云金芽孢桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3AfAa的編碼基因，其堿基序列如SEQ?ID?No.2所示。該編碼基因是通過以下思路設計并合成的：

（1）獲取Vip3Af2基因（GenBank?Accession?No：DD319822）中編碼Vip3Af2蛋白N端400個氨基酸的1200個堿基序列；

（2）獲取Vip3Aa1基因（GenBank?Accession?No：L48811）中編碼Vip3Aa1蛋白C端389個氨基酸的1167個堿基序列；

（3）嵌合步驟（1）和（2）獲得的兩個堿基序列，獲得一個初步改造的原始堿基序列；