[發明專利]miRNA-20a作為哺乳動物宿主細胞凋亡調控靶標的應用

無效

• 申請號: 201310354271.2
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103397035A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 張兵兵;鮮成玉;侯汝濤;徐洪記
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N5/07
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明屬于細胞工程和基因工程技術領域，涉及一種miRNA作為遺傳重構的靶標在哺乳動物宿主細胞重構改良中的應用。

背景技術

用哺乳動物細胞大規模培養生產重組蛋白類藥物的重要性日益突出。為了滿足新產品的研發和巨大的生產需求，對中國倉鼠卵巢細胞（Chinese?hamster?ovary?cell，CHO）等生產用的宿主細胞進行各種策略的遺傳工程改造，克服其不適應工業化生產的諸多缺點，是實現哺乳動物宿主細胞生產重組蛋白類藥物的基礎，而發現可用于細胞工程化改造的靶點是關鍵。

以哺乳動物細胞為宿主生產蛋白質藥物，具有細菌、酵母等宿主細胞所不具備的優勢。與低等微生物宿主細胞相比，哺乳動物細胞表達系統可以提供準確的轉錄后修飾功能，包括蛋白折疊、二硫鍵形成、亞基多聚化、蛋白磷酸化以及糖基化等，因而表達的重組蛋白在結構和功能方面更接近天然的蛋白質。由于這些優點，目前已經上市或正在進行臨床研究的基因工程藥物中，大約70%由哺乳動物細胞生產。在各種哺乳動物細胞表達系統中，CHO細胞是生產抗體或糖蛋白的首選宿主細胞。但CHO細胞同其它哺乳動物細胞一樣，存在一些不適合工業化大規模培養的缺點，如增殖率低、對培養環境的要求高、對各種應激環境的耐受能力差，各種不利的環境因素如營養缺乏、有害代謝產物積累、溶氧過高或過低、機械攪拌等均可影響細胞增殖，引起細胞凋亡，尤其在無血清培養基中，細胞更容易發生凋亡。為了解決上述問題，優化培養條件是一條重要途徑，如優化反應器設計和控制，使之更準確的控制溫度、溶氧、pH等參數；優化攪拌方式，降低對細胞的機械損傷；優化培養基設計，在培養基中添加抗凋亡抑制劑，補充各種營養成份和生長因子，使細胞在無血清和無蛋白培養基中高活力生長等。另一條可行的途徑是對細胞自身進行遺傳改造，培育更能適應工業化生產的工程細胞株。目前的主要手段是從參與代謝過程的生長因子、酶等蛋白的基因入手，通過改變這些重要蛋白（或肽）的表達水平，使細胞具有更適合大規模培養的特性。例如，通過基因重組將轉鐵蛋白和胰島素生長因子基因轉染到CHO細胞中，使之獲得在無血清培養基中的生長能力；通過遺傳改造調控Bcl-2凋亡蛋白家族成員或Bcl-X抗凋亡家族成員的表達，提高細胞的抗凋亡能力等。

MicroRNA（miRNA）是一種內源性的具有調控功能的單鏈非編碼RNA，一般長18-22nt，在生物體中廣泛存在，并發揮著重要的生物學調控作用。miRNA主要通過種子序列（Seed?sequence）與靶基因mRNA的3’-UTR區結合，改變mRNA的穩定性和翻譯效率。miRNA的產生不經過蛋白質翻譯過程，具有多靶點性，并且對不同的靶mRNA抑制程度不同，因此是一種非常靈活高效的基因表達轉錄后調控方式，在生物響應環境應激、適應環境變化的過程中發揮了重要作用。將miRNA作為哺乳動物宿主細胞遺傳重構靶點具有諸多優勢，miRNA是較小的RNA分子，在功能獲得和缺失性表達中都不會占用細胞的蛋白質翻譯資源，這對于重組蛋白生產非常有利；miRNA能對多個靶點進行不同程度的調控，而這些靶基因往往存在于相關聯的信號網絡中，因此可能比以往對個別功能蛋白進行改造具有更大的優勢，對細胞表型產生更為深刻的影響；另外，miRNA對靶蛋白的表達不是完全抑制，比基因敲除等方法對細胞的毒性作用可能更小。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種miRNA作為哺乳動物宿主細胞凋亡調控靶標的應用，采用基因工程技術改變該miRNA在哺乳動物宿主細胞中的表達量，間接調控與細胞凋亡相關蛋白的表達量，進而提高宿主細胞的抗凋亡能力。

為達到上述目的，經研究，本發明提供如下技術方案：

1．miRNA-20a作為哺乳動物宿主細胞凋亡調控靶標的應用。

進一步，所述哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞，所述miRNA-20a的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

2．調控哺乳動物宿主細胞凋亡的方法，通過提高miRNA-20a的表達來抑制哺乳動物宿主細胞凋亡。

進一步，所述哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞，所述miRNA-20a的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

進一步，所述提高miRNA-20a的表達是向哺乳動物宿主細胞中轉入miRNA-20a前體序列，所述miRNA-20a前體序列如SEQ?ID?No.2所示。

3．miRNA-20a在抑制轉錄因子E2F1表達中的應用。