[發(fā)明專利]一種酶法制備瑞鮑迪甙M的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310353500.9
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103397064A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陶軍華;李國慶;梁曉亮;托馬斯·李;格雷戈瑞·葉普
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司;百事可樂公司
• 主分類號: C12P19/56
• 分類號: C12P19/56;C12R1/185;C12R1/865
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 32103
• 代理人: 汪青

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種瑞鮑迪甙M的制備方法，特別涉及一種瑞鮑迪甙M的生物制備方法。

背景技術(shù)

甜味劑是一類廣泛應(yīng)用于食品、飲料及糖果生產(chǎn)的食品添加劑。其既可以在食品的生產(chǎn)過程中添加，也可以在家庭烘焙時經(jīng)過適當(dāng)稀釋作為蔗糖的替代品使用。甜味劑包括天然甜味劑和人工甜味劑，前者如蔗糖、高果糖玉米糖漿、蜜糖等，后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一類從植物甜菊中提取出來的天然甜味劑，目前已被廣泛用在食品及飲料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鮑迪甙在內(nèi)的多種甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差異較大，需要后續(xù)的提純。目前商業(yè)化的產(chǎn)品瑞鮑迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鮑迪甙C，D及F等。提取的方法制備的甜菊糖通常還有混有一些雜質(zhì)，有可能對其使用范圍造成一定的影響。瑞鮑迪甙M相較于瑞鮑迪甙A具有優(yōu)勢，但其在甜菊葉中的含量極少，且只在甜菊Morita植株中被檢測到（2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209）。目前尚未有瑞鮑迪甙M的商業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種酶法制備瑞鮑迪甙M的方法，該方法可以較低的成本，較短的周期生產(chǎn)出高純度的瑞鮑迪甙M產(chǎn)品。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

一種酶法制備瑞鮑迪甙M的方法，該方法以瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D為底物，使所述底物在葡萄糖基供體存在下，在UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和/或含有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組細(xì)胞的催化下反應(yīng)生成瑞鮑迪甙M。

根據(jù)本發(fā)明，所述葡萄糖基供體可以為UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的UDP-葡萄糖再生體系（2007，F(xiàn)EBS?Letters，581，2562–2566）。其中，優(yōu)選由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP組成的UDP-葡萄糖再生體系，UDP葡萄糖價格較高，采用由UDP-葡萄糖再生體系可以大幅度降低成本。

根據(jù)本發(fā)明，UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（即脲苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，簡稱UGT）是已知的。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為來自甜菊（Stevia?rebaudiana）的UGT-A和/或來自水稻（Oryza?sativa）的UGT-B。

UGT-A的氨基酸序列可以與序列2具有至少60%的一致性。優(yōu)選地，UGT-A的氨基酸序列與序列2具有至少70%的一致性。進(jìn)一步優(yōu)選地，UGT-A的氨基酸序列與序列2具有至少80%的一致性。最優(yōu)選地，UGT-A的氨基酸序列與序列2具有至少90%的一致性。根據(jù)一個具體方面，UGT-A的氨基酸序列與序列2完全一致。

UGT-B的氨基酸序列可以與序列4具有至少60%的一致性。更優(yōu)選地，UGT-B的氨基酸序列與序列4具有至少70%的一致性。進(jìn)一步優(yōu)選地，UGT-B的氨基酸序列與序列4具有至少80%的一致性。最優(yōu)選地，UGT-B的氨基酸序列與序列4具有至少90%的一致性。根據(jù)一個具體方面，UGT-B的氨基酸序列與序列4完全一致。

根據(jù)本發(fā)明，可以使所述反應(yīng)在溫度4℃～50℃以及pH5.0～9.0的水相體系中進(jìn)行。優(yōu)選地，使所述反應(yīng)在溫度25℃～35℃以及pH6.5～7.5的水相體系中進(jìn)行。

更優(yōu)選地，使反應(yīng)在溫度30℃下進(jìn)行。

更優(yōu)選地，使反應(yīng)在pH7.0下進(jìn)行。

根據(jù)一個具體優(yōu)選方面，使反應(yīng)在pH7.0的磷酸緩沖液中進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)采用含有UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的重組細(xì)胞來進(jìn)行所述催化時，可以使所述反應(yīng)在細(xì)胞通透劑存在下進(jìn)行。優(yōu)選的，所述細(xì)胞通透劑為甲苯，其在整個反應(yīng)體系中的體積比濃度可以為1%～3%。更優(yōu)選地，甲苯的體積比濃度為2%。

根據(jù)本發(fā)明，所述的重組細(xì)胞可以且優(yōu)選為微生物細(xì)胞，其中微生物可以且優(yōu)選為大腸埃希氏桿菌、釀酒酵母或畢赤酵母等。

根據(jù)一個具體和優(yōu)選方面，所述方法實施如下：將反應(yīng)所用的全部原料加入到反應(yīng)釜中，混合均勻后，置于設(shè)定溫度下，攪拌反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，通過提純處理即可獲得達(dá)到使用要求的瑞鮑迪甙M產(chǎn)品。一個具體的提純方方法是經(jīng)包括樹脂分離在內(nèi)的后處理，按照該提純方法，可獲得純度高達(dá)95%的瑞鮑迪甙M產(chǎn)品。