[發明專利]藥用阿魏內生菌的擴繁方法

在審

• 申請號: 201310353245.8
• 申請日: 2013-08-14
• 公開（公告）號: CN103436469A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 李曉瑾;朱軍;孫麗;樊叢照;阿伊別克·熱合木都拉
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/14
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 李伯勤

技術領域

本發明涉及一種藥用阿魏內生菌的擴繁方法。

背景技術

植物體內普遍存在著內生菌，由于其生活在沒有外在感染癥狀的健康植物組織內部，因此植物內生菌的存在和作用長期以來未被發現。

直到20世紀30年代，由于牲畜食了感染內生真菌的牧草，給畜牧業造成重大損失，才開始對植物內生菌有了初步認識。

植物內生菌作為植物微生態系統的重要組成部分，在長期的協同進化過程中，與植物形成了互惠互利或者危害植物生長等關系。大部分內生菌具有增強宿主對外界環境的應激耐受性、促進宿主植物的生長及宿主中一些有效活性成分的合成（或自身具有合成某化合物能力）等方面的作用，深入研究可能對藥用植物的人工種植及提高藥用植物產量等具有重要作用。

阿魏味苦、辛，性溫，歸脾、胃經，有消積、散痞、殺蟲的功效，是我國的傳統中藥，也是新疆特有的珍稀藥材，被收入歷版《中華人民共和國藥典》一部，是基源為新疆阿魏(Ferula?sinkiangensis?K.M.?Shen)或阜康阿魏(Ferufukanensis?K.M.?Shen)的樹脂。

因藥用阿魏植物自身生理生殖等方面的限制和長期以來的亂采濫挖，目前其資源遭到巨大破壞，已瀕臨滅絕，并被三級重點保護瀕危植物。

藥用阿魏內生菌主要有真菌、細菌和和放線菌，這些微生物的次級代謝產物及其與阿魏屬植物生長的相關性等進行研究，對恢復藥用阿魏的生態資源具有重要的意義。

而在實際應用研究中，需要大量地用到內生菌菌體，而且菌體的培育又需要一個較長的過程，阿魏的藥用原植物是多年生一次開花的早春類短命植物，含有豐富的樹膠，但隨著株齡逐年累積，這些樹膠對內生菌的獲得造成一定的困難，造成研究中菌體的嚴重缺乏，因此一定數量的菌體儲備關系到研究的正常進行。

因此，對阿魏內生菌進行分離，特別是對菌體的培養和擴繁,?為進一步開發利用阿魏的藥用原植物提供足夠數量的菌體,進而恢復藥用阿魏原植物的生態資源,具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種藥用阿魏內生菌的擴繁方法。

本發明的目的主要是通過以下過程實現的：

外植體制作：取新鮮的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作為外植體，切成0.5～2cm的小段，經濃度65～85%的酒精消毒0.5～1.5分鐘，再經濃度2～4%的次氯酸鈉消毒5～8分鐘，之后無菌水洗滌3～5次，瀝干水置于2～5℃環境中保存備用。

真菌的分離及培養：將上述消毒的外植體，切成0.3～0.6cm小塊接種到培養基中，每個培養皿最好接種3～7塊。

所用的真菌培養基為麥麩培養基、孟加拉紅培養基中的一種。

在溫度23～27℃下，暗培養4～8天，待菌絲長出后，挑取菌絲尖端，置于PDA培養基中逐級純化，直至形成單個菌落。

所述的逐級純化為：將不純的菌落挑取邊緣菌絲置于培養皿中純化培養至單菌落，對于未純化的菌落，繼續挑取邊緣純化直至變為單菌落。

細菌的分離及培養：取消毒后的阿魏外植體，勻漿，然后按重量用無菌水稀釋成含量為10^-3～10^-6的稀釋液，置入牛肉膏蛋白胨培養基中，在溫度為36～39℃下暗培養24～48小時后，挑取單個菌落逐級劃線培養，直至形成單個菌落。

所述的逐級劃線培養：將不純的菌落挑單菌落劃線培養至單菌落，對于未純化菌落，繼續挑菌劃線培養，直至變為單菌落。

放線菌的分離及培養：取消毒后的阿魏外植體，勻漿，然后按重量用無菌水稀釋成含量為10^-2～10^-5的稀釋液，置入高氏一號培養基中暗培養14～21天后，挑取邊緣少量菌絲逐級純化培養，直至形成單個菌落。

所述的逐級純化為：將不純的菌落挑取邊緣菌絲置于培養皿中純化培養至單菌落，對于未純化的菌落，繼續挑取邊緣純化直至變為單菌落。

上述的細菌和放線菌的稀釋液最好按以下步驟進行配制：取消毒后的阿魏外植體,?放入已消毒的研缽中研碎呈漿狀，按每1克漿狀體，加入8～12毫升無菌水，混勻后靜置20分鐘以上,然后從中吸取上清液體，再按1毫升加入8～12毫升無菌水，混勻后靜置20分鐘以上，依次繼續稀釋，得到所需的稀釋液。

如果在已經擁有內生菌菌種的情況下,可直接進入培養擴繁。