[發明專利]樟芝高產三萜菌株及其應用

有效

• 申請號: 201310351660.X
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103392512A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 趙宗杰;謝海濤;蔡青松
• 申請（專利權）人: 深圳市仁泰生物科技有限公司
• 主分類號: A01G1/04
• 分類號: A01G1/04;C07J63/00
• 代理公司: 深圳市恒申知識產權事務所(普通合伙) 44312
• 代理人: 陳健

技術領域

本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種經紫外誘變原生質體所選育得到的三萜類化合物產量高的樟芝新菌株及其應用。

背景技術

樟芝又叫牛樟芝（Antrodia?cinnamomea），是原產于臺灣的珍稀藥用真菌，具有極大的藥用價值，被譽為“抗癌圣藥”、“保肝之王”、“解毒之王”，也是目前價格最貴的藥用真菌?，F代醫學研究證實，樟芝的主要活性成分為三萜類化合物。而野生樟芝數量稀少，人工培植的樟芝子實體雖然具有與野生樟芝相似的三萜成分，但子實體生長緩慢，遠遠不能滿足市場需求。目前，采用現代生物技術進行人工發酵是獲得樟芝三萜類化合物的最佳途徑，人工發酵技術主要分為固體發酵和深層液體發酵。樟芝固體發酵周期較長(90-180天)，固體發酵產物中總三萜含量約5%左右，遠低于野生子實體中10%-45%的總三萜含量；樟芝液體發酵周期相對較短(7-14天)，但產物中基本不含三萜類化合物。因此，這兩種人工發酵方式都存在發酵周期長、三萜產量低的缺點。菌種是決定發酵水平的內在因素，多種藥用真菌通過誘變育種均顯著提升了藥用活性成分的產量，實現了藥用真菌的產業化生產。李剛（2001）、李穎穎等（2011）通過常規誘變育種分別獲得了靈芝高產多糖和三萜的優良菌株；張日?。?004）通過化學和物理組合誘變篩選到了高產蛋白酶的芽孢桿菌；應漢杰等（2007）通過低能粒子束注入孢子的方式獲得了高產核酸酶P1的桔青霉菌。類似的研究不勝枚舉，可見，通過誘變育種提高食藥用真菌的活性物產量不失為一種有效的手段。

截止目前，有關樟芝的誘變育種研究鮮有報道，僅有的文獻資料顯示，青島農業大學山東省應用真菌重點實驗室的田雪梅等人（2012）通過物理誘變獲得了5株樟芝誘變株，其中編號為327的菌株為多糖和蛋白質高產菌株，多糖和蛋白質的產量分別比出發菌株提高238.2%和10.33%。Gg為三萜高產菌株，三萜產量比出發菌株提高57.86%，液體發酵總三萜產量為18mg/L，折合成干燥菌絲體總三萜含量為0.47%，但是事實上這個三萜含量并不算高，離產業化要求尚有很大差距。

因此，現有技術還有待于改進和發展。

發明內容

鑒于上述現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種樟芝高產三萜菌株及其應用，旨在解決現有樟芝菌株人工發酵時三萜類化合物產量低的問題。

在本發明方案中，采用的是紫外誘變原生質體的方法。菌種誘變育種包括物理誘變和化學誘變，常見的物理誘變方法有紫外誘變、微波誘變、空間誘變、⁶⁰Co-γ射線輻照誘變、X射線誘變、離子注入誘變等，化學誘變劑主要有烷化劑、堿基類似物、羥胺、吖啶色素等。其中，紫外誘變具有操作簡單、誘變效率高、可重復性強、誘變源易于獲得等優點，成為很多生物材料誘變育種的常規手段。

樟芝屬于大型真菌，它的孢子外殼堅韌，如果直接用孢子作為誘變材料不僅需要高強度誘變處理，且成功概率低，即使誘變成功也難以在人工條件下萌發。而樟芝菌絲體多為鏈狀復合細胞體，單個細胞發生誘變難以篩選出來，因此菌絲體也不宜作為誘變材料。目前比較先進的做法是原生質體間接誘變，即利用生物酶法去除細胞壁制備原生質體，原生質體對外界環境較為敏感、經誘變處理后很容易發生突變，且再生菌落由單細胞發育而來，容易篩選，再生菌株可以保持原有菌種的主要生物學特點，育種周期大大縮短，突變株生物學性狀比較穩定，不易退化。

關于出發菌株的選擇，誘變育種所采用的出發菌株也十分關鍵。目前全世界各菌種保藏機構的樟芝菌種有十幾種之多，多數從自然界野生樟芝的子實體或牛樟樹樹洞中分離而來，這些菌株的菌絲體長勢較弱、在平板和液體培養基中生長緩慢。本發明采用菌種編號為ATCC200183的樟芝菌種作為出發菌株，該菌株菌絲體相對粗壯，在平板和液體培養基中生長速度相對較快，用它作為出發菌株有利于篩選出理想的樟芝優良菌種。

本發明的目的是獲得在液體培養條件下高產三萜類化合物的樟芝高產三萜菌株。在篩選過程中，以樟芝菌絲體長滿平板所需的時間和搖瓶發酵菌絲體總三萜產量為考察指標，利用紫外線對樟芝原生質體進行反復誘變，來獲得高產三萜類化合物的樟芝新菌株。