[發(fā)明專利]一種無動物源性和人源性成分T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310351472.7
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN104371972A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 謝志明;武寧
• 申請（專利權(quán)）人: 英普樂孚生物技術(shù)(上海)有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于培養(yǎng)人類T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基配方及其制備方法。?

背景技術(shù)

T細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的主要組分之一，它具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助其它淋巴細(xì)胞發(fā)揮功能，對特異性抗原或促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等，是身體抵御疾病感染、防止腫瘤形成的主要免疫細(xì)胞之一。在體外富集、活化、擴增這類免疫細(xì)胞，可用于回輸治療多種疾病，包括惡性腫瘤、感染、自身免疫病等，在這個過程中，需要用到一種可以在體外支持T細(xì)胞存活和擴增的培養(yǎng)基。?

T細(xì)胞在體外存活和擴增需要的營養(yǎng)物質(zhì)包括：氨基酸、維生素、糖、脂質(zhì)、無機鹽、生長因子等。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基為了提供這些營養(yǎng)因子，大多采用動物或人的血清作為添加物，比較常見的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清等。使用牛血清的優(yōu)點是有足夠的量供應(yīng)，價格便宜，但是使用牛血清的缺點是有潛在傳播傳染病的風(fēng)險，以及由于異種蛋白導(dǎo)致過敏癥的發(fā)生，而且牛血清并不能很好的支持人T淋巴細(xì)胞的生長(Imir，P等，Clin.Immunol.Immunopath.，36：289-296(1985))。使用人AB血清的可以很好的支持人T淋巴細(xì)胞的生長，但是人AB血清來源困難，供應(yīng)量有限，而且也存在傳播疾病的風(fēng)險。因此，以臨床應(yīng)用為目的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中應(yīng)盡量避免使用動物來源和人體來源的原料。?

戴育成(申請公布號：CN102191215A)發(fā)明了一種用于培養(yǎng)CIK細(xì)胞的人源性無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有多種人血來源的成分，包括人白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人膽固醇、人過氧化氫酶等，證實可以培養(yǎng)和誘導(dǎo)CIK細(xì)胞，優(yōu)于有血清培養(yǎng)基。任秀寶(授權(quán)公告號：CN1261562C)發(fā)明了一種用于培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有動物來源或人體來源的轉(zhuǎn)鐵蛋白，證實培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果與含2％人血清的培養(yǎng)基相當(dāng)。Invitrogen公司生產(chǎn)的用于體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基AIM-V也含有人體來源的人血白蛋白和人轉(zhuǎn)鐵蛋白。Invitrogen公司的另一款用于體外培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基Optmizer也只是不含有動物來源的成分，但還是含有人體來源的人血白蛋白和人轉(zhuǎn)鐵蛋白。這些培養(yǎng)基中都或多或少地添加了動物來源或人血來源的成分，雖然有嚴(yán)格的檢測和病毒滅活的處理，但是還是存在一定的安全性隱患。?

綜上所述，作為治療用的T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基，應(yīng)該有以下幾個特點：安全、穩(wěn)定、廉價等。本發(fā)明著力于解決上述問題，提供了一種更加安全，質(zhì)量更穩(wěn)定且成本低廉的T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基，而且其培養(yǎng)人T淋巴細(xì)胞的效果與含人血清的培養(yǎng)基相當(dāng)，部分指標(biāo)優(yōu)于含人血清培養(yǎng)基。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及到一種用于培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基的組成成分和制備方法。為達(dá)到提高安全性的目的，避免任何因為使用含動物來源的成分或人體來源的成分可能帶入的傳染性疾病，本培養(yǎng)基所使用的所有原料均為非動物源性的原料和非人體來源的原料。本培養(yǎng)基通過上述方法改進，安全性優(yōu)于以往的T細(xì)胞培養(yǎng)基，同時培養(yǎng)效果得到進一步提升。?

具體來說，本發(fā)明由以下部分組成：?

一種用于體外培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法包括但不限于以下幾個方面：?

a)T細(xì)胞的獲?。篢細(xì)胞可以來源于外周血、淋巴組織、骨髓、腫瘤組織、?胸腹腔積液等部位，在此過程中，為防止凝血，可加入肝素或枸櫞酸做抗凝劑。?

b)T細(xì)胞的分離：取自上述部位的細(xì)胞種類繁多，如有必要可進一步提純和分離得到純度更高的T細(xì)胞，常用的分離方法包括Ficoll密度梯度離心法、免疫磁珠吸附法、貼壁吸附法、裂解法等。?

c)T細(xì)胞的培養(yǎng)：將細(xì)胞懸液用培養(yǎng)基配成細(xì)胞濃度每毫升10萬個到500萬個，接種到培養(yǎng)容器中，加入T細(xì)胞刺激因子，常用的包括IL-2、抗CD3單抗、IFN-r、抗CD28單抗、植物血凝素、抗原遞呈細(xì)胞等，于37度、5％二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)擴增，一般培養(yǎng)7-30天。擴增倍數(shù)和殺瘤活性受培養(yǎng)基、刺激因子、細(xì)胞來源、氧氣等因素的影響。?

d)T細(xì)胞的鑒定：一般采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，T細(xì)胞包括CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+等細(xì)胞群。?

本培養(yǎng)基由于在上述培養(yǎng)方法中，可以特異地支持T細(xì)胞的擴增和長期存活，表現(xiàn)為培養(yǎng)后，含有T細(xì)胞表型的細(xì)胞比例增加，細(xì)胞總數(shù)增加，因此用作T細(xì)胞的培養(yǎng)基。?

本發(fā)明內(nèi)容中涉及到一種用于擴增活化T淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基的優(yōu)點在于它不含有任何動物來源和人體來源的成分，因此有更高的安全性。?