[發明專利]一種純化DNA的方法

有效

• 申請號: 201310350182.0
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN103408625A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 惠長野;楊徑;張文;楊學琴;黃先青;高朝賢;李智民;李麗梅;王佃鵬
• 申請（專利權）人: 深圳市職業病防治院
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/06
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種純化DNA的方法。

背景技術

目前國內開發的核酸類產品以保健品為主，但頗受爭議。大連珍奧核酸（CN1169434），為由豆類提取的小分子核酸（DNA+RNA），輔以維生素、微量元素。安泰核酸（CN1225210），為以豬胰臟酶解制成的小分子DNA及肽類的混合物。正分子核酸，為鮭魚精DNA，輔以花粉、維生素。日本在核酸功能性食品方面的研發則更為活躍。核酸作為營養保健食品的生產用原料，對純度要求并不高，目前采用的制備方法多以生物酶解、物理、化學方法為主。

針對多個藥物靶點篩選的核酸適體藥物已被FDA批準上市。歐美的研究重點集中在采用生化方法制備核酸及其降解產物上：15,000-30,000Da的單鏈寡DNA（去纖苷）在溶血及內皮細胞保護上表現出了廣闊的開發前景，針對肝小靜脈閉塞癥的臨床試驗已經開展到Ⅲ期；4,000-10,000Da的單鏈寡DNA表現了良好的局部抗缺血活性（CN1073448）；最近的研究表明4,000-10,000Da的單鏈寡DNA和去纖苷在抗惡性腫瘤血管新生方面極具開發潛力，輔助治療多發性骨髓瘤已進行到Ⅱ期臨床試驗。這類寡脫氧核苷酸藥用分子多采用注射給藥，制備原料為動物組織及臟器來源的DNA，對蛋白質殘留及分子量分布有較嚴格的要求。分子量分布在1500-550,000Da的動物來源DNA鈉鹽的等張溶液可以作為血漿代用品，要求異源蛋白質殘留少于1.5%，用于治療人體嚴重的急性和慢性損傷，并具有免疫調節作用。哺乳動物臟器提取RNA生產注射劑可用于惡性腫瘤、重癥肝炎的輔助治療。動物臟器經組織勻漿粗提后，為保證蛋白質的去除效果，一般需經苯酚、氯仿、異戊醇等有機溶劑抽提，毒性較大且不易去除，難以保證終產品安全性。酚仿抽提是分子生物學實驗中提純DNA的主要方法，但并不適用于大規模純化藥用級DNA。工業生產中大規模抽提DNA的通常步驟為：細胞組織勻漿后，用1mol/L氯化鈉高鹽提取核蛋白、通過堿裂解、生物酶解去雜蛋白，制備的DNA產品可滿足保健食品的質量需求，但仍殘留有微量雜蛋白及小分子寡核苷酸，不能直接用于制備寡核苷酸藥物。

發明內容

本發明的目的是提供一種純化DNA的方法。

本發明提供了一種從粗品DNA中精制DNA的方法，包括如下步驟：

（1）取粗品DNA，用水溶解并調pH至2.5-5.0，得到質量百分含量為0.5-6.0g/100mL的DNA溶液；

（2）將步驟（1）得到的DNA溶液上樣于陽離子交換樹脂柱并收集流出液；

（3）取步驟（2）得到的流出液，加入無機鈉鹽并使其濃度為0.5-1.5mol/L，調pH至6.5-7.5；

（4）取步驟（3）得到的溶液，加入等體積的無水乙醇以沉淀DNA；

（5）將步驟（4）得到的DNA沉淀烘干，然后用水溶解，得到質量百分含量為1.0-6.0g/100mL的DNA溶液；

（6）將步驟（5）得到的DNA溶液進行干燥，得到DNA精制品（藥用級DNA產品）。

所述步驟（1）中，可采用40-70℃（如60℃）攪拌的方式促進粗品DNA的溶解。所述步驟（1）中，具體可用0.5mol/L?HCl水溶液調節pH。所述步驟（1）中，所述pH具體可為3.0。所述步驟（1）中具體可將60g粗品DNA用1L去離子水溶解。市售粗品DNA多提取自動物臟器，組織勻漿后，高鹽提取、堿裂解等物理、化學方法及生物酶解法雖可以保證去除大多數蛋白質，但仍殘留有少量蛋白，尤其是與DNA結合的富含堿性氨基酸的組蛋白及其降解產物。絕大多數蛋白質等電點均高于4.0，調節pH值至3.0，一方面可保證雜蛋白帶正電荷，另一方面可保證DNA的穩定性。