[發(fā)明專利]一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310350122.9
• 申請日: 2013-08-13
• 公開（公告）號: CN103710370A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設計）人: 劉仁虎;王伏林;鄭滔;郎春秀;吳關庭;石江華;胡張華;金衛(wèi);陳錦清
• 申請（專利權）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏;鄭汝珍

1.一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：?1）采用AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn的融合基因表達結構構建基因表達載體，其中AMP1至AMPn可以是不同抗菌肽，也可以是相同抗菌肽，n可以任意自然數(shù)，一般為3至10，LP為植物內(nèi)肽酶識別和剪切序列；2）將構建的可剪切的抗菌肽融合表達載體轉(zhuǎn)入作物中，使抗菌肽在轉(zhuǎn)基因作物中高效表達，而后植物體內(nèi)的內(nèi)肽酶作用于內(nèi)肽酶識別位點LP?，使融合抗菌肽剪切為單個有活性的抗菌肽單元。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：采用AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn的融合基因表達結構構建基因表達載體包含如下步驟：1）設計成AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn的融合基因表達結構；2）根據(jù)設計的融合抗菌肽編碼序列合成基因；3）將合成的基因克隆獲得抗菌肽基因融合表達載體；4）構建植物遺傳轉(zhuǎn)化載體；5）構建植物表達載體后利用該載體轉(zhuǎn)化植物。

3.根據(jù)權利要求2所述的一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：?AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn的融合基因表達結構的形成包含以下步驟：1）將多種抗菌肽或多拷貝同種抗菌肽（AMP）通過基因融合表達的方法構建串聯(lián)融合表達載體，同時在融合表達的不同抗菌肽單元間設計內(nèi)肽酶剪切位點（LP）；2）根據(jù)植物密碼子偏好設計融合抗菌肽的基因編碼序列，將抗菌肽和剪切肽相互間隔排列，形成AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn的融合基因表達結構，其中AMP1至AMPn可以是不同抗菌肽，也可以是相同抗菌肽，n可以任意自然數(shù)，一般為3至10。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：根據(jù)設計的融合抗菌肽編碼序列合成基因是：按照AMP1-LP-AMP2-LP-AMP3……LP-AMPn融合表達的次序，密碼子優(yōu)化后合成基因。

5.根據(jù)權利要求2所述的一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：將合成的基因克隆獲得抗菌肽基因融合表達載體：是將合成的基因克隆于pMD18-T載體，反復酶切和連接操作可獲得任意拷貝數(shù)的抗菌肽基因融合表達載體。

6.根據(jù)權利要求2所述的一種利用抗菌肽融合表達提高轉(zhuǎn)基因植物抗病性的方法，其特征在于：植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構建：是將克隆獲得的多個抗菌肽基因融合表達載體中的外源基因插入片段用NcoⅠ+?XbaⅠ雙酶切切下，連入pFGC5941相應酶切位點，構成植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pFGC-n×AMPs，融合的抗菌肽基因數(shù)目n為任意自然數(shù)，一般為3至10，該載體采用2×35S啟動子驅(qū)動外源基因表達。