[發(fā)明專利]利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感疫苗的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310348977.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103394081A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬云龍;張嬌嬌;李山峰;李立莉;李靜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江省百洲生物工程有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/145
• 分類號(hào): A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京康思博達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種禽流感疫苗的生產(chǎn)方法，尤其涉及一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，屬于禽流感疫苗的生產(chǎn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

當(dāng)前，禽流感疫苗主要由雞胚來(lái)生產(chǎn)，這種傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法存在勞動(dòng)強(qiáng)度大、雞胚來(lái)源不穩(wěn)定、需要繁瑣的純化工藝去除雞胚蛋白減少過(guò)敏反應(yīng)，同時(shí)還存在著難以避免的細(xì)菌污染和外源病毒的感染等諸多問(wèn)題，而用生物反應(yīng)器替代雞胚生產(chǎn)疫苗株則克服了上述所述不足，成為最具有前途的禽流感疫苗生產(chǎn)技術(shù)之一。

WAVE波浪生物反應(yīng)器是采用拋棄型生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的一種新型反應(yīng)器，其工作方式是，細(xì)胞接種于可拋棄的細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)，接種細(xì)胞的培養(yǎng)袋固定在托盤(pán)上以一定的方式搖動(dòng)，精密控制的搖動(dòng)保證了培養(yǎng)體系的有效混合和傳氧效率。采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，主要優(yōu)點(diǎn)有：1）免除生物反應(yīng)器清洗、消毒及其相關(guān)認(rèn)證。2）封閉培養(yǎng)系統(tǒng)，無(wú)需固定的管道，簡(jiǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)廠房，縮短反應(yīng)器安裝和生產(chǎn)產(chǎn)品轉(zhuǎn)換時(shí)間。3）細(xì)胞培養(yǎng)袋Cellbag放在特殊設(shè)計(jì)的搖動(dòng)平臺(tái)上，平臺(tái)的搖動(dòng)在培養(yǎng)液中產(chǎn)生波浪提供培養(yǎng)物混合和氧氣傳遞，產(chǎn)生一個(gè)適于細(xì)胞生長(zhǎng)的完美環(huán)境。

采用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感疫苗時(shí)，所加入微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)袋的搖動(dòng)參數(shù)等生產(chǎn)條件對(duì)于禽流感疫苗的生產(chǎn)效率有非常顯著的影響，在生產(chǎn)實(shí)踐中需要對(duì)這些條件進(jìn)行優(yōu)化才能有效提高禽流感疫苗的生產(chǎn)效率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，該方法對(duì)微載體的含量、細(xì)胞接種密度、細(xì)胞培養(yǎng)條件等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，有效提升了禽流感疫苗的生產(chǎn)效率。

本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

一種利用WAVE波浪生物反應(yīng)器生產(chǎn)禽流感疫苗的方法，包括：（1）細(xì)胞的培養(yǎng)：將MDCK細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)袋中的微載體上，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)袋培養(yǎng)細(xì)胞；（2）病毒液的增殖：沉降微載體，洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，接種禽流感病毒毒種，加入病毒增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，收獲病毒液；（3）將病毒液滅活后，乳化，得到禽流感疫苗；其中，所述的搖動(dòng)條件為擺動(dòng)角度7°、擺動(dòng)速度為16rpm。

采用WAVE波浪生物反應(yīng)器培養(yǎng)MDCK細(xì)胞時(shí)，搖動(dòng)培養(yǎng)參數(shù)對(duì)于細(xì)胞在微載體上的吸附以及細(xì)胞生長(zhǎng)有非常顯著的影響，為了篩選到最適宜的搖動(dòng)培養(yǎng)參數(shù)以最大限度的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，本發(fā)明對(duì)搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的擺動(dòng)角度以及擺動(dòng)速度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化考察，觀察不同的培養(yǎng)條件對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)所帶來(lái)的影響。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)袋中的細(xì)胞進(jìn)行搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，擺動(dòng)角度以及擺動(dòng)速度對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)有非常顯著的影響；本發(fā)明最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)的培養(yǎng)條件為擺動(dòng)角度7°、擺動(dòng)速度為16rpm能夠最為顯著的促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，該培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著高于其它的培養(yǎng)條件。

此外，細(xì)胞接種密度與微載體含量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響也密切相關(guān)，其中重要的標(biāo)志是接種時(shí)要保證合適的細(xì)胞密度與載體的比例關(guān)系。在每克微載體接種相同細(xì)胞數(shù)的前提下，本發(fā)明考察微載體（Cytodex1）含量為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，用來(lái)確定合適的載體用量。為了生產(chǎn)高滴度的病毒，需要細(xì)胞密度較高，同時(shí)，為了較快和高效的培養(yǎng)細(xì)胞，又要求細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較高。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，隨著微載體含量的增加，細(xì)胞密度會(huì)有所增加，但細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較低。當(dāng)微載體含量為2g/L時(shí)，不僅細(xì)胞密度高，細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)也較高。

在確定了微載體最適宜用量的基礎(chǔ)上，本發(fā)明為2g/L的微載體用量，分別以不同的接種密度接種細(xì)胞，每天取樣分析，以篩選最適宜的細(xì)胞接種密度。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，從表3可以看出，當(dāng)微載體含量相等，不同的接種密度對(duì)MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大。以5×10⁴、1×10⁵個(gè)/mL接種時(shí)，接種密度低接種后5天仍在緩慢生長(zhǎng)，沒(méi)有進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期的明顯標(biāo)志；以2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵個(gè)/mL接種時(shí)接種密度高，MDCK細(xì)胞在接種后第2天進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期；隨著細(xì)胞接種密度的增高，MDCK細(xì)胞生長(zhǎng)速度的增加并不與細(xì)胞接種密度增加保持同步；當(dāng)MDCK細(xì)胞接種密度為2×10⁵個(gè)/mL時(shí)，MDCK細(xì)胞在第4天和第5天后的生長(zhǎng)速度要明顯高于其它接種密度的生長(zhǎng)速度，因此，本發(fā)明優(yōu)選采用2×10⁵個(gè)/mL的接種量接種MDCK細(xì)胞。