[發(fā)明專利]雙酶法制備瑞舒伐他汀側(cè)鏈中間體的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310347204.8
• 申請日: 2013-08-12
• 公開（公告）號: CN104372039A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳令偉
• 申請（專利權(quán)）人: 南京朗恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C12R1/19
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 顧進

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥和生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種瑞舒伐他汀側(cè)鏈中間體的酶法制備方法。

背景技術(shù)

他汀類藥物是目前世界上最暢銷的藥物大類，它對膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A（HMG-CoA）還原酶具有強烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物，特別是阿托伐他汀和瑞舒伐他汀近些年都進入了全球最暢銷藥前十名。(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯是合成瑞舒伐他汀的關(guān)鍵手性中間體，可以通過化學(xué)法或生物法加以制備。目前國內(nèi)主要通過化學(xué)法生產(chǎn)，化學(xué)還原方法的反應(yīng)條件往往需要低溫(如-70?℃)，及易燃的硼烷類化合物參與，成本高，純度低，污染尤其嚴(yán)重，對環(huán)境的影響非常大。相對于傳統(tǒng)化學(xué)法，生物法具有反應(yīng)溫和，效率高，三廢產(chǎn)生少等優(yōu)點，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

目前生物法主要是利用生物催化(5S)-6氯-3-羰基-5-羥基己酸叔丁酯制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯。例如美國專利US2008/0248539?公開了一種利用來自于釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)?的酮還原酶及其突變株還原法生產(chǎn)(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，該方法利用外源添加的葡萄糖脫氫酶和輔酶因子來維持反應(yīng)的進行，而且在反應(yīng)中會產(chǎn)生葡萄糖酸，需用堿維持反應(yīng)的pH，增加了操作程序，影響反應(yīng)的原子經(jīng)濟性。由于(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯有兩個手性位點，目前生物法分兩步還原反應(yīng)制得，如附圖1。反應(yīng)過程由2步生物法和1步化學(xué)法組成。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，系統(tǒng)性研究兩個生物催化反應(yīng)的特性，提供一種一鍋法催化制備(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，先利用化學(xué)法合成底物，優(yōu)化傳統(tǒng)反應(yīng)路線，篩選到合適的生物催化劑，同時進行兩步還原反應(yīng)，即兩步反應(yīng)可用一鍋法完成，如此進行生產(chǎn)，反應(yīng)步驟簡單，可以節(jié)省生產(chǎn)原料和和動力能源的消耗，有效地節(jié)省了成本，在工業(yè)化應(yīng)用具有十分重要的意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：雙酶法制備瑞舒伐他汀側(cè)鏈中間體的方法，其特征在于：在反應(yīng)容器中加入配制好的水相緩沖液，然后依次加入一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、異丙醇、生物催化劑，于溫度25℃～40℃下攪拌反應(yīng)，利用氣相色譜方法（GC）檢測反應(yīng)進程，至轉(zhuǎn)化率達到80％～100％，分批加入另一部分底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯，繼續(xù)進行反應(yīng)，至反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達到95%～100％時結(jié)束反應(yīng)，加入乙酸乙酯多次萃取，合并有機相并蒸發(fā)脫去溶劑，即得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯。

進一步地，所述的生物催化劑的形式為含有酮還原酶基因KRED1和KRED2的重組大腸桿菌或重組酮還原酶的粗酶液。

進一步地，所述的生物催化劑的制備方法為：將含有酮還原酶基因KRED1和KRED2的重組大腸桿菌單菌落分別接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)4～8小時，將培養(yǎng)得到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于30～38℃下，搖床180-220rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD₆₀₀值達到0.8～1.2時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度1mM，于22～32℃下繼續(xù)培養(yǎng)16～20小時，4℃下離心收集菌體，加入生理鹽水清洗菌體2遍，再次離心收集菌體即得含有重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞；用2～8倍體積的三乙醇胺緩沖液（2mM，pH7.0）懸浮細胞，細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘，4℃下15000g離心30min，上清液即得重組酮還原酶的粗酶液。

進一步地，所述的水相緩沖液為pH?6.0～8.0?的磷酸鹽緩沖液或三乙醇胺緩沖液，濃度為50～300mM。其中更優(yōu)選磷酸鹽緩沖液，pH6.5～7.5。

進一步地，所述的催化體系在使用重組酮還原酶的粗酶液為生物催化劑時，添加NADP作為反應(yīng)輔因子，添加量為底物量的0.03%-0.3%（w/w）；在使用重組酮還原酶的大腸桿菌全細胞為生物催化劑時，無需添加輔因子NADP。

進一步地，在反應(yīng)體系中加入的Ca²⁺、Mg²⁺等二價金屬離子，濃度為0.1-20mM，不僅可以增加大腸桿菌細胞的通透性，而且這些離子還是酮還原酶的增強劑。其中更優(yōu)選Ca²⁺，根據(jù)一個具體方面，所述的反應(yīng)體系中所用的為CaCl₂。