[發明專利]一種納米固定化纖維素酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310347131.2
• 申請日: 2013-08-09
• 公開（公告）號: CN103397014A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 李書潤;廖文強;危巖
• 申請（專利權）人: 北京維康雙元生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊

技術領域

本發明涉及生物化工領域，特別涉及一種納米固定化纖維素酶的制備方法。

背景技術

國際原油價格的不斷攀升和全球污染問題的日益加重，世界各國都在不遺余力地研發新能源，而生物乙醇是被普遍看好的新型燃料。進入21世紀，利用纖維素酶轉化纖維素物質產生葡萄糖進而發酵獲得生物乙醇，可以避免對糧食作物的大量損耗，引起了各國政府和研究機構的重視，這其中的關鍵是纖維素酶的成本問題。

由于纖維素酶發酵活力較低，因此其應用成本也較高。纖維素酶相比其他糖苷水解酶類，比活力至少要低1～2個數量級，從而造成酶的作用效率較低。另外由于天然纖維素酶多為一次性直接使用，使用成本高，阻礙了該轉化過程的工業化。這是限制纖維素酶商業化大規模生產纖維素乙醇的瓶頸問題，也是纖維素酶研究的熱點與難點。

盡管目前現有的技術可以制備纖維素乙醇，但在生產過程中使用的酶尤其是纖維素酶不能回收、不能重復使用、酶成本太高，導致無法進行規模化生產。

目前針對這一問題的解決方案是，通過傳統的菌種誘變和基因工程技術可以較大幅度地提高目的蛋白的表達量，從而提高酶的發酵水平。還可以通過改善發酵條件和工藝，如采用固體發酵來大幅度降低發酵成本。但是提高酶降解天然纖維素的效率則需要深入研究纖維素酶的結構與功能以及作用方式，進而對其進行有效改造；或者通過篩選新的產酶菌種，發現具有開發潛力的新酶源。但不論如何改進工藝、優選菌株，都不能無限制的提高酶活力。另外，自由酶本身存在局限性，如穩定性差、不易儲存、不能回收反復使用等。因此，從纖維素酶本身入手解決纖維素乙醇生產時酶成本過高的瓶頸的方案已經收到限制。

采用纖維素酶的固定化，有利于酶的回收和再利用，有望解決該酶生產應用的實際問題。固定化酶與游離酶相比，具有不可比擬的優點，主要表現在：首先，酶與產物易于分開，因而可以回收再利用；其次，在一定程度上可以改善酶的操作性能和穩定性；第三，可以多次反復使用和連續操作，降低生產成本；第四，酶不混入產物，可以精簡分離工序等。固定化纖維素酶的以上優點使得纖維素乙醇生產過程中酶成本顯著降低，有望實現纖維素乙醇商業化生產。

目前應用的固定化纖維素酶方法，存在以下問題：使用表面活性劑：戊二醛、氨水、醋酸、聚乙烯醇、span80等；需要低溫冷凍、或者高溫；且需要反復凍融；酶活性保留率低，約在40%左右；這些不足，導致制備固定化纖維素酶時，制備過程復雜、環境不友好、不能工業化生產。

發明內容

本發明的發明目的是提供一種納米固定化纖維素酶的制備方法，通過控制制備方法中的參數，使制得的納米固定化纖維素酶相對自由酶活性在85%以上，且所述方法制備的納米固定化纖維素酶可多次回收使用且酶活性幾乎保持不變。

本發明所述納米固定化纖維素酶的制備方法，包含以下步驟：

步驟1：攪拌下向正硅酸乙酯加入HCl溶液，經過水解得到透明溶液；

步驟2：將水解得到的透明溶液冷卻，回收乙醇，控制透明溶液乙醇的體積百分含量＜1%；

步驟3：在攪拌下向透明溶液加入葡萄糖溶液，再加入纖維素酶檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，最后加入堿性溶液調節pH值為中性，轉入4-10℃成膠；

步驟4：將成膠得到的濕膠研磨，水洗除去葡萄糖，將水洗后的混合液進行抽濾得到白色的凝膠，將凝膠進行干燥，研磨，過篩備用。

本發明所述納米纖維素酶的制備過程為：

首先在常溫下以鹽酸為催化劑將正硅酸乙酯水解，水解完畢之后得到無色透明的溶膠，采用抽真空的方式回收水解過程中產生的副產物乙醇，然后在攪拌下依次加入模版葡萄糖溶液、纖維素酶緩沖溶液，最后加入氫氧化鈉溶液調節體系的pH值到中性，放置生成凝膠，當凝膠化完成之后，把凝膠研磨粉碎，再用水進行洗滌以除去凝膠體系中的葡萄糖模版，最終得到固定化有纖維素酶的納米介孔材料。

反應原理如下：

正硅酸乙酯在酸或堿催化下的水解反應方程式為：

5Si(OC₂H₅)₄+12H₂O→5SiO₂+12C₂H₅OH