[發明專利]一種黑曲霉組成型表達元件、表達載體、重組黑曲霉及其構建方法和應用有效
| 申請號： | 201310344706.5 | 申請日： | 2013-08-08 |
| 公開（公告）號： | CN103421794A | 公開（公告）日： | 2013-12-04 |
| 發明（設計）人： | 王永華;藍東明;王衛飛;楊博 | 申請（專利權）人： | 華南理工大學 |
| 主分類號： | C12N15/113 | 分類號： | C12N15/113;C12N15/80;C12N15/66;C12N1/15;C12N9/20;C12R1/685 |
| 代理公司： | 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245 | 代理人： | 宮愛鵬 |
| 地址： | 510640 廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 曲霉 組成 表達 元件 載體 重組 及其 構建 方法 應用 | ||
1.一種黑曲霉組成型表達元件，其特征在于，所述表達元件由黑曲霉轉錄延伸因子基因啟動子和黑曲霉轉錄延伸因子基因終止子組成；所述黑曲霉轉錄延伸因子基因啟動子由1490、990或690個堿基組成，序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3所示；所述黑曲霉轉錄延伸因子基因終止子由1022個堿基組成，序列如SEQ?ID?NO.5所示。
2.由權利要求1所述黑曲霉組成型表達元件構建表達載體的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1)提取黑曲霉的基因組DNA，設計引物，利用PCR技術，并以黑曲霉基因組DNA為模板，擴增并克隆長度為1490、990或690個堿基的黑曲霉轉錄延伸因子基因的啟動子和長度為1022個堿基的終止子，分別命名為Ptef1490、Ptef990、Ptef690、和Ttef；
2）將Amds基因通過kpnI和XhoI內切酶克隆進入pbluescript載體中，獲得中間載體一；將Ptef基因片段利用XhoI和HindIII內切酶克隆進入上述中間載體一中，獲得中間載體二；將Ttef基因片段利用XbaI和NotI克隆進入中間載體二，獲得黑曲霉表達載體pTef。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述引物序列如下：
4.權利要求2或3所述方法構建的表達載體。
5.由權利要求4所述表達載體構建重組黑曲霉的方法，其特征在于，包括以下步驟：
1）將脂肪酶calb基因克隆到黑曲霉表達載體pTef中，使用內切酶為EcoRI和XbaI，獲得calb表達載體pTef-calb；
2）將pTef-calb轉化黑曲霉原生質體，篩選陽性重組菌株，即得到重組黑曲霉GAP3-calb。
6.權利要求5所述方法構建的重組黑曲霉。
7.權利要求6所述重組黑曲霉在制備工業酶制劑或藥用蛋白質中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述工業酶制劑為脂肪酶、蛋白酶、植酸酶或木聚糖酶。
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