[發明專利]用于檢測齒蘭環斑病毒的引物、試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201310344684.2
• 申請日: 2013-08-08
• 公開（公告）號: CN103436634A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 陳定虎;陳祖華;王宏;曹小茂;楊雷亮;彭志民;劉恭源;王勇;朱春紅
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 中山市銘洋專利商標事務所(普通合伙) 44286
• 代理人: 鄒常友

技術領域

本發明涉及一種用于檢測齒蘭環斑病毒的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

蘭花是享譽全球的花卉，深受全世界人民的喜愛，我國每年都有數以億計的蘭花苗進出境，然而由于蘭花非常容易攜帶病毒，特別是最容易攜帶的劍蘭花葉病毒Cymbidium?mosaic?virus(CymMV)和齒蘭環斑病毒Odontoglossum?ringspot?virus(ORSV)，且脫毒目前還非常困難，嚴重制約了我國蘭花產業可持續的健康發展和國外的技術壁壘的制約，因此，唯有切實加強進出境植物病毒的檢疫，不斷研究和開發新的檢測方法，不斷提高對進出境蘭花種苗攜帶的病毒進行高精準的檢測能力，及早將病毒植株淘汰出去，方能從根本上保證無毒苗的大量生產，才能進一步促進我國蘭花產業的發展。

植物病毒病的診斷和病原鑒定，是認識病毒病害、防治病毒病的基礎，也是植物病毒分類學研究的一個重要內容，植物病毒檢測的基本內容包括病毒的生物學特性、形態學特征、理化特性、基因組結構、抗原特性等幾個方面，涉及到生物學測定、血清學測定、生理生化測定、電鏡技術、分子生物學技術等多種手段。目前，我國出入境植物檢疫所采用的檢測技術的主要手段主要是：口岸現場檢疫、生長季隔離檢疫、指示植物檢驗、血清學檢驗、分子生物學檢驗。這些手段存在的主要問題為：1：檢測周期長，不符合國務院提出的“加快通關速度”的精神；2：容易出現假陽性反應；3：檢測方法繁瑣復雜，不利于基層單位實際應用；4：主要檢測試劑或產品來源于國外公司，不僅購買價格高，而且定購時間長，這些都不能適應我國經濟快速發展的需要。因此，建立新的快速有效的檢驗檢疫技術手段已經迫在眉睫。

目前對病毒的主要技術檢測方法是酶聯免疫吸附（ELISA）檢測和反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測。ELISA可以定性、定量測定樣品中的病毒，是實現目前鑒定病毒的最好手段之一。但是，血清學反應的必須具備高效的抗血清，另外血清學檢測對一些病毒含量低和含有干擾測定物質的樣品則不能做出準確的測定，容易出現假陽性的結果，并且存在檢測時間長的問題，不能滿足目前口岸快速檢測的要求；RT-PCR技術是應用最廣泛的分子生物學新技術之一，利用RT-PCR技術對病毒的檢測相比ELISA檢測具有靈敏度高的特點，可檢測的最低病毒含量達到fg水平。目前在RT-PCR技術基礎上不斷衍生出許多新的技術，例如實時熒光RT-PCR技術，基因芯片技術等，使其應用范圍不斷擴大，特異性和敏感性也不斷提高，但是這些分子生物學技術存在RNA抽提繁瑣并且容易降解，PCR反應容易受寄主中多酚、多糖物質的干擾，限制了植物病毒病害樣品的快速、簡便、高效檢測。

納米生物技術是運用納米技術的理論與方法，在傳統生物學和現代分子生物技術的基礎上，開展生物學研究。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應用價值：（1）高效富集：納米磁珠比表面積大，顯著增加反應界面能夠高效富集生物樣品；（2）可操縱性：納米磁珠具有超順磁效應，外加磁場能夠快速對其進行移動和分離;（3）標記性質：生物分子標記方法簡單、可靠；（4）人體安全：對人體無毒、可生物代謝、可生物降解、生物相容性好。總之，磁性生物分離兼具磁性載體的超順磁性和親和配基的生物特異性特點，集磁性分離的快速簡便和親和分離的高選擇性雙重優勢于一體，在核酸的分離純化，RNA、DNA分子的富集，蛋白的純化，病毒、細胞的分離等方面有應用。

關于納米磁珠（magnetic?nano?particles，MNP）的合成，國外在80年代末開始超順磁性氧化鐵超微顆粒的研究，基于納米磁珠的生物分離材料國外已經有市場化產品，最近納米磁珠在動物病毒檢測得到應用，抗體標記的納米磁珠從液相中捕獲目標病毒，可以高靈敏度地檢測動物病毒。

而環介導核酸等溫擴增即Loop-mediated?isothermal?amplification（LAMP）技術是最近幾年才發展起來的病毒檢測新方法，為快速基因檢測提供了一種新的技術途徑，已具有成功應用的現實性，在食品安全檢測、流行性病毒檢測、臨床診斷，以及水產養殖等領域的應用及研究已有文獻報道。它不需要昂貴的檢測設備，只需要一臺溫箱即可，而且其檢測靈敏度比普通PCR檢測方法還要高，而且檢測時間不超過一小時，結果直接目測即可，特別適合口岸一線檢測。

環媒等溫核酸擴增反應利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環，LAMP擴增分兩個階段。