[發明專利]一種低數量級誘變細胞的高通量分析系統與計數方法

有效

• 申請號: 201310344391.4
• 申請日: 2013-08-08
• 公開（公告）號: CN103424350A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 潘天紅;黃彪;邢讃;孫京京
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: G01N15/10
• 分類號: G01N15/10
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 李媛媛

技術領域

本發明涉及一種細胞統計技術與分析系統，特別是涉及一種低數量級的、誘變細胞的高通量統計方法與分析系統，屬于細胞基因毒性分析領域。

背景技術

基因毒性(Genotoxicity)是指一些物質具有的特性，該特性能損害細胞內基因信息，破壞細胞內遺傳物質的完整性。在大多數情況下，基因毒性可以使不同細胞和其它身體系統產生異變，從而引發生物體的各種疾病（如癌癥，即：身體內的失去控制細胞生長）。

在自然環境中，往往存在著大量的藥物或污染物，這些物質具有一定基因毒性，可使正常細胞發生誘變，產生誘變細胞，導致生物體發生癌變。因此，通過統計誘變細胞數目，可以鑒定藥物或污染物的危害等級，從而預測環境污染物對人體健康產生有害影響的可能性，即：實現人類健康風險評估。但是，自然環境中的誘變劑濃度都非常低，低濃度的誘變劑產生誘變細胞數目也非常少，受檢測靈敏度的限制，傳統的細胞計數方法很難統計出低數量級的誘變細胞數目，例如：若培養皿中的誘變細胞數目不足100時，MTT比色法無法實現檢測。

專利“一種高精度細胞統計技術與分析裝置”[申請號：201210062508.5，公開號：CN102851208A]提出一種基于圖像分析技術的細胞統計方法，通過調節顯微成像裝置，獲取清晰的細胞顯微圖片，并對圖片進行一系列的圖像操作，獲取識別結果，并對結果進行統計分析，得到所檢測細胞的個數，尺寸與形態等。此方法需要一套高精度的顯微成像系統，常用于正常細胞計數，并且無法實現高通量檢測。

專利“用于對細胞和生物分子進行計數的系統和方法”[申請號：200980121707.5，公開號：CN102089418A]將細胞的樣本與熒光標記試劑接觸，并利用熒光光束，由檢測設備成像技術，配以計算機軟件，實現對待測細胞的計數。此方法是一種侵入式的檢測方法，需要熒光標記試劑，細胞的活性受到熒光標記試劑的影響，實驗員受感染的機會較大，且其測試步驟單一枯燥，實驗員容易疲勞、出錯，無法實現高通量檢測。

發明內容

針對上述現有技術的不足，本發明提出一種結合實時細胞分析儀（Real?Time?Cell?Analyzer，RTCA）的誘變細胞的分析系統與計數方法，能實現低數量級誘變細胞的高通量檢測。

依據本發明之目的，提出一種低數量級誘變細胞的高通量分析系統，該系統包括用于監測細胞生長和控制其生長環境參數的PC機/筆記本電腦、用于維持細胞生長環境的細胞培養箱（incubator），一高通量的96x微電極板（E-Plate）、正常細胞、誘變細胞和誘變劑；其中，PC機/筆記本電腦安裝有ACEA公司開發的實時細胞監控軟件平臺，該平臺能控制細胞培養箱的環境參數，如：溫度、濕度，以及二氧化碳濃度，從而保持細胞生長環境條件的均勻性；并能實時檢測微電極板E-Plate的阻抗變化信號，并將該信號轉化成細胞指數（Cell?Index，CI）顯示在屏幕上，同時也存儲在PC機/筆記本電腦硬盤中；96x微電極板置于細胞培養箱中，細胞培養箱的環境參數（溫濕度，二氧化碳濃度）由實時細胞監控軟件控制，從而保持在整個誘變過程的環境條件不變；正常細胞接種在96x微電極板中，誘變細胞和誘變劑加在96x微電極板的微孔中。

其中，正常細胞接種在96x微電極板（E-Plate）中，細胞會貼壁生長，其數量變化會導致E-Plate底部的金箔傳感器的阻抗發生變化，微電極上的貼壁細胞越多,阻抗值變化就越大，實時細胞監控軟件將這種變化轉化成細胞指數（CI），顯示在系統中。

利用上述分析系統的計數方法，包括如下步驟：正常細胞接種在96x微電極板中12小時后，在不同的微孔（well）中加入不同數量的誘變細胞與誘變劑，誘變劑將正常細胞全部殺死，讓誘變細胞生長，利用實時細胞監控軟件平臺記錄整個誘變細胞的生長曲線，并分析該誘變細胞響應曲線的動態特征，計算得到誘變細胞響應曲線的基準值和閾值；在此基礎上，建立誘變細胞數目與生長時間之間的關系方程，即估計模型，再利用非線性回歸算法，辨識得到該估計模型的參數，利用辨識的估計模型實現對低數量級、待測誘變細胞數目的計數。

本發明的細胞計數方法包括如下步驟：

（1）將正常細胞接種在96x的微電極板的微孔（well）中；

（2）等待正常細胞穩定12小時后，在微電極板的不同的微孔中加入不同數量的誘變細胞與誘變劑；

（3）誘變劑殺死正常細胞后，剩下的誘變細胞繼續生長，實時細胞監控軟件平臺控制并記錄整個誘變過程（200小時），記錄并存儲不同誘變細胞的生長曲線；