[發明專利]唾液腺組織特異性的轉基因載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201310343067.0
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103509812A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 張獻偉;吳珍芳;李紫聰;劉德武
• 申請（專利權）人: 吳珍芳;李紫聰
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、分別以質粒pcDNA3.1(+)和pT2AL200R175-CAGGS-EGFP為模板，SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6、及SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8為引物進行第一次PCR擴增，獲得帶有若干重疊序列的neo基因和EGFP基因；各取0.5-3μL混合后作為模板進行第二次PCR擴增，純化得到neo-EGFP融合基因；用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切pcDNA3.1(+)和neo-EGFP融合基因，純化回收酶切產物，連接，構建得到pcDNA-Neo-T2A-EGFP載體；

(2)、以質粒pPB-UbC-EGFP-neo為模板，分別以SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10、及SEQ?ID?NO:11和SEQ?ID?NO:12作為引物，進行PCR擴增得到NotⅠ-5-PB-NotⅠ，XhoⅠ-3-PB-XhoⅠ，分別采用NotⅠ和XhoⅠ酶切后，連接在載體pPSPBGPneo-XynB上，得到載體pPSPBGPneo-PB-XynB；

(3)、以步驟(1)得到的pcDNA-neo-T2A-EGFP載體為模板，用長片段PCR體系，SEQ?ID?NO:13和SEQ?ID?NO:14作為引物進行PCR擴增得到infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段，切膠純化；用ClaⅠ和BglⅡ雙酶切步驟(2)得到的載體pPSPBGPneo-PB-XynB，對目的片段切膠純化；將infusion-CMV-neo-T2A-EGFP片段重組到pPSPBGPNeo-PB-XynB載體的兩個loxp位點中間，得到pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB載體；

(4)、以步驟(3)得到的pPSPBGPneo-T2A-EGFP-PB-XynB載體為模板，SEQ?ID?NO:15和SEQ?ID?NO:16作為引物，進行PCR擴增，得到載體中的pPB-lox-neoEGFP-loxp片段，并添加AgeI限制性內切酶位點，純化，得到新載體骨架；

(5)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，SEQ?ID?NO:17和SEQ?ID?NO:18為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4009bp片段，將4009bp片段與新載體骨架pPB-lox-neoEGFP-loxp中的重組序列進行重組，得到中間載體1；

(6)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ?ID?NO:19和SEQ?ID?NO:20為引物，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游4706bp片段；將其重組到步驟(5)的中間載體1的StuI位點，即為中間載體2；

(7)、以小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段為模板，以SEQ?ID?NO:21和SEQ?ID?NO:22為引物，利用AgeI位點，擴增得到小鼠腮腺蛋白上游調控區的下游3956bp片段；將其重組到步驟(6)的中間載體2上，得到載體pPB-MusPSP-neo-EGFP，即為唾液腺組織特異性的轉基因載體。

2.根據權利要求1所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(5)-(7)中的小鼠腮腺蛋白基因上游調控區的PCR擴增片段的克隆方法為：以FVB小鼠基因組DNA為模板，SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2為引物，KOD-FX聚合酶進行第一次PCR擴增；以第一次擴增的產物為模板，SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4為引物，進行第二次PCR擴增，即得。

3.根據權利要求2所述的唾液腺組織特異性的轉基因載體的構建方法，其特征在于，所述第一次PCR擴增的反應程序為：94℃2min；98℃?10s，74℃?13min，5cycles；98℃?10s，72℃?13min,5cycles；98℃?10s，70℃?13min，5cycles；98℃?10s,68℃?13min,30cycles；68℃?7min；所述第二次PCR擴增的反應程序為：94℃?2min；98℃?10s,68℃?13min,30cycles；68℃?7min。