[發明專利]針對大腸桿菌O157的RNA恒溫擴增核酸檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201310342966.9
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103421896A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 尹華立;于明輝;張長明;朱鳳;居金良
• 申請（專利權）人: 上海仁度生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術領域

本發明涉及致病菌的生物檢測技術，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合的大腸桿菌O157(O157)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。

背景技術

大腸桿菌O157，屬腸桿菌科，埃希氏菌屬，是主要的腸道致病菌之一，腸出血性大腸桿菌（EHEC）O157:H7被WHO定為新的食源性致病菌，可引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥和血小板減少性紫癜等。大腸桿菌O157感染常與生牛肉，鮮牛奶或以鮮奶為原料加工的乳制品有著密切的關系。其他已知的傳播途徑有生牛奶、香腸、烤肉、未經氯消毒的市政用水、蘋果汁、生蔬菜、沙拉和蛋黃醬。此外食品也可能被感染大腸桿菌O157的食品加工人員污染。

目前國內食品中大腸桿菌O157檢測方法主要以國家標準GB/T4789.6-2008和行業標準SN/T0973-2010為依據，這些標準多依賴于傳統的分離培養、鏡檢觀察、生化鑒定、血清學分型等實驗，一般的檢測周期在5～7天左右，存在著檢驗周期長，工作量大等缺點。由于其檢測周期長、程序復雜、所需試劑繁多等缺點，已遠遠不能滿足現代檢測要求。隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展。目前已公開了很多檢測E.coli?O157的方法，如PCR及熒光PCR方法（行業標準：SN/T1869-2007、SN/T2754.2-2011）。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術（SimuLtaneous?AmpLification?and?Testing，簡稱SAT）是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者能夠檢測活菌，核酸擴增在一個溫度下進行（42℃），無需熱循環。采用M-MLV逆轉錄酶和T7RNA多聚酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結果。SAT技術直接以病原微生物特異性RNA為擴增靶標，以擴增產物RNA為檢測靶標，而自然界中病原微生物死亡后靶標RNA會快速降解，從而實現食品致病菌活菌檢測。

發明內容

為解決現有的大腸桿菌O157(O157)檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易引起擴增物的污染造成實驗結果的假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題，本發明提供了一種檢測周期短、高靈敏度、高特異性、能避免假陽性、低污染、反應穩定以及檢測成本低、易于推廣應用的大腸桿菌O157(O157)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。

本發明所提供的大腸桿菌O157(O157）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增），包含有一條捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生O157靶標核酸（O157RNA）的DNA拷貝的O157檢測引物T7和nT7，和一條用于與在T7RNA聚合酶作用下根據所述O157靶標核酸（O157RNA）的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的O157檢測探針。

所述捕獲探針可與如序列表中序列1所示的大腸桿菌O157(O157)的靶標核酸（O157RNA）序列特異結合，在有O157內標（O157IC?RNA）時，其最好還可與該O157內標序列特異結合,所述捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示；所述O157檢測引物由T7引物和nT7引物組成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；所述O157檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。

進一步，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕獲探針存在于一核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和O157檢測探針存在于一O157檢測液中。

再進一步所述試劑盒還包含有O157內標和內標檢測探針；所述O157內標為競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并與O157靶標核苷酸（O157RNA）使用同一對引物（T7和nT7），O157內標由序列表中序列7所示的O157IC?RNA；所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列6所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，

更進一步，所述試劑盒包含裂解液、核酸提取液、洗滌液、O157反應液、O157檢測液、SAT酶液、O157陽性對照、O157陰性對照和O157內標，其中：

裂解液：含硫酸銨（(NH₄)₂SO₄）和HEPES；