[發明專利]一種rTRAIL突變體-單甲基化聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯物及其應用

有效

• 申請號: 201310342861.3
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103408654A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 陳樞青;潘利強
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C07K14/525
• 分類號: C07K14/525;C07K1/107;A61K38/19;A61K47/48;A61P35/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于生物技術和藥物領域，具體涉及一種rTRAIL突變體-單甲基化聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯物及其應用。

背景技術

腫瘤壞死因子（TNF）相關的凋亡誘導配體（TNF?related?apoptosis-inducing?ligand，TRAIL）是繼TNF、FasL之后發現的第三個TNF家族的凋亡因子，為一種抗癌應用前景良好的生物藥物。TRAIL由Wiley等從心肌cDNA文庫中克隆出來的，因其氨基酸順序具有TNF超家族的結構特征并能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉化的人類淋巴細胞凋亡而得名。許多臨床前期研究表明TRAIL能有效誘導多種癌細胞系凋亡，并同時保護正常細胞免于細胞毒副反應。目前國外已進行關于TRAIL及其受體激動型抗體的Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗，并取得初步療效。另外，TRAIL對NF-κB僅有很微弱的激活作用，即使是全身用藥，也不會像TNF-α和Fas-L那樣產生嚴重的炎癥反應，這些特性使得TRAIL有成為新一代抗腫瘤藥物的潛質。

Sarah?G.Hymowitz等研究發現TRAIL在形成三聚體時生物活性最強，同時受體激活時也成三聚體形式，三聚體頂部附近的鋅結合位點對維持TRAIL的結構與穩定性起到重要作用，TRAIL分子中還存在一些特殊位點，第109位的天冬氨酸（Asp）是一個潛在的N糖基化位點，可被金屬蛋白酶從膜上切下而產生一相對分子質量為24000左右的可溶性活性肽段（114-281），稱為rTRAIL。該片段可形成分子量分別為48000和66000左右的二聚體和三聚體，TRAIL的藥物應用多采用此肽段。離體實驗表明，全長或可溶形式的TRAIL形成的三聚體都可以快速誘導多種腫瘤細胞凋亡。與TNF家族其它成員相比，TRAIL最獨特的區別在于，其第137-152位氨基酸序列可形成一個由12-16個氨基酸組成的凸出的環（AA?loop）,此結構可插入受體的TRAIL結合位點，從而保證受體與TRAIL特異性結合，研究表明，此插入環與TRAIL細胞毒性作用有關。另外，TRAIL序列中Cys230殘基在維持TRAIL的結構和生物活性中具有重要作用。若Cys230突變為Ala或Ser，TRAIL蛋白的穩定性下降，而且不能螯合鋅原子形成三聚體，與受體結合能力也會下降200倍，嚴重影響TRAIL的誘導凋亡的活性。然而，TRAIL的半衰期短（10～30分鐘）、不穩定和生物利用度低等缺點制約了其在臨床研究上的進一步發展。

聚乙二醇（PEG）是一種pH中性、無毒、水溶性較高的親水聚合物，其重復單元為氧乙烯基，端基為兩個羥基，呈線性或支化鏈狀結構，PEG聚合物是迄今為止已知聚合物中蛋白和細胞吸收水平最低的聚合物。由于PEG無毒且具有良好的生物相容性，PEG已被FDA批準可作為體內注射藥用聚合物。PEG化是一項用于延長蛋白質半衰期、增加可溶性和穩定性的技術。美國食品與藥品監督管理局（FDA）批準上市了許多PEG化蛋白藥物，如PEG-asparaginase，deaminase等，證明了該項技術的安全性和有效性。因此，研究者們選擇用聚乙二醇對TRAIL進行修飾，以克服其上述的缺點。他們選擇用單甲基化聚乙二醇乙醛（mPEG-ALD）對TRAIL進行PEG修飾，因為在低pH（pH=5）的條件下，mPEG-ALD可以與TRAIL的N端特異性反應，然后經硼氫化鈉還原后形成穩定的PEG-TRAIL偶聯物。但是研究者為了穩定TRAIL的三聚體結構，在TRAIL的N端與PEG之間引入了亮氨酸拉鏈（LZ），形成PEG-HZ-TRAIL。這種偶聯物的不足之處在于：首先，LZ-TRAIL據文獻報道具有肝毒性，盡管針對PEG-HZ-TRAIL的研究表明其能改善LZ-TRAIL的肝毒性，但這始終是一個隱患；其次，PEG-HZ-TRAIL只保留了原有TRAIL大約7.3%左右的活性，表明這種PEG修飾方式對TRAIL的活性影響較大；最后，PEG-HZ-TRAIL的偶聯需要12h的時間。

因此亟需尋找另一種偶聯速率快、最大程度保留TRAIL活性和除去了肝毒性隱患的PEG化TRAIL，來解決上述問題。

發明內容

本發明提供了一種rTRAIL突變體-單甲基化聚乙二醇馬來酰亞胺偶聯物，利用單甲基化聚乙二醇馬來酰亞胺（mPEG-MAL）對rTRAIL突變體進行定點修飾，不僅最大程度地保留了rTRAIL的抗腫瘤活性，還大大延長了rTRAIL的半衰期，而且不存在肝毒性隱患。