[發(fā)明專利]一種抗腫瘤血管生成單克隆抗體的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310342738.1
• 申請(qǐng)日: 2013-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103396493A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭志剛;潘林莉;高婷婷;曹艷;周婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/30
• 分類號(hào): C07K16/30;C40B30/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種抗腫瘤血管生成單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述抗腫瘤血管生成單克隆抗體的制備方法包括以下步驟：

細(xì)胞受體蛋白VEGFR2的表達(dá)純化、制備全人源化噬菌體Fab抗體庫(kù)、從噬菌體抗體庫(kù)中篩選高親和力抗體、將純化的VEGFR2固定在Biacore的CM5芯片上，分別測(cè)試不同濃度的AVR2抗體與VEGFR2的結(jié)合和解離速度；

以抗體和抗原高親和力和高特異性為基礎(chǔ)的抗體庫(kù)篩選；

將抗體基因克隆到表達(dá)細(xì)胞、構(gòu)建高表達(dá)量工程細(xì)胞株、抗血管生成的檢測(cè)及評(píng)價(jià)。

2.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤血管生成單克隆抗體的制備方法，其特征在于，VEGFR2胞外區(qū)即VEGFR2-ECD的基因克隆的具體方法為：

步驟一、收集VEGFR2胞外區(qū)序列；

步驟二、設(shè)計(jì)引物：N端加His-tag；C端加F，酶切位點(diǎn)BamH?I、Hind?III；

步驟三、以VEGFR2為模板，擴(kuò)增出胞外區(qū)；

步驟四、克隆到PET28a；

步驟五、挑取單克隆測(cè)序；

步驟六、將VEGFR2克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，并與抗體的Fc區(qū)整合表達(dá)；

步驟七、用Protein?A-beads對(duì)VEGFR2-ECD-Fc進(jìn)行親和純化；

步驟八、純化后的蛋白進(jìn)行凝膠過(guò)濾，進(jìn)一步去除雜蛋白。

3.如權(quán)利要求1所述的抗腫瘤血管生成單克隆抗體的制備方法，其特征在于，制備全人源化Fab抗體庫(kù)的具體方法為：

步驟一、淋巴細(xì)胞的分離：

取當(dāng)天采集的抗凝血150份，每份1mL，取3份血樣混勻，1∶1用生理鹽水稀釋；

15mL的離心管中加入6mL的淋巴細(xì)胞分離液，沿管壁輕輕加入6mL稀釋后的血液，400g、1500r/min離心15min；

用移液槍吸取淋巴細(xì)胞層，置于另一離心管，液體分層，從上至下依次為血漿、淋巴細(xì)胞層、分離液以及紅細(xì)胞層，顏色依次為黃色、白色、無(wú)色透明、紅色；

加6mL生理鹽水洗滌細(xì)胞，500g、1800r/min離心20min，棄上清，重復(fù)一次，收集沉淀即為淋巴細(xì)胞；

步驟二、細(xì)胞總RNA的提取：

向淋巴細(xì)胞中加入400μLTrizol，用移液槍反復(fù)吹打，室溫裂解15min，轉(zhuǎn)移至用DEPC水處理的EP管中，每管加入80μL氯仿，Vtrizol∶V氯仿＝5∶1，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min；

置于高速冷凍離心機(jī)，4℃、12000r/min，離心10min；

吸取上層水相置于另一個(gè)EP管中，加入200μL預(yù)冷的異丙醇，渦旋振蕩，沉淀出RNA，室溫下培育20min；

4℃、12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用200μL預(yù)冷的75％乙醇清洗，4℃、7500r/min離心5min，棄上清，干燥3-5min；

30μL?DEPC處理的雙蒸水重懸干燥后的RNA，-70℃長(zhǎng)期保存，也可進(jìn)入cDNA合成步驟；

紫外吸收法檢測(cè)RNA純度和濃度；

步驟三、cDNA的合成：

cDNA的合成的具體步驟如下：

配制RT反應(yīng)液，反應(yīng)液配置在冰上進(jìn)行；

輕柔混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，條件如下：

37℃??15min??反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，

85℃??5sec??反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)，

4℃??保存；

將反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA混勻，置于-20℃保存，也可以進(jìn)入PCR步驟；

步驟四、可變區(qū)基因的擴(kuò)增：

第一輪PCR擴(kuò)增

以cDNA作為模板，進(jìn)行可變區(qū)基因的第一輪PCR擴(kuò)增，其中，對(duì)于來(lái)源于IgM的HC可變區(qū)的擴(kuò)增，正向引物位于IgM恒定區(qū)，反向引物位于重鏈可變區(qū)的5’端；對(duì)于輕鏈的擴(kuò)增，由于其存在κ和λ兩種亞型，因此，需要按亞型分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行擴(kuò)增，正向引物位于輕鏈恒定區(qū)的3’端，反向引物位于輕鏈可變區(qū)的5’端；

(1)反應(yīng)體系：

(2)PCR條件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，28循環(huán)；72℃10min，其中，重鏈產(chǎn)物使用9個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)擴(kuò)增獲得，而輕鏈則產(chǎn)生6個(gè)獨(dú)立的V_κC_κ擴(kuò)增產(chǎn)物，11個(gè)V_λC_λ擴(kuò)增產(chǎn)物(HuCλF1和HuCλF2引物被混合后加入同一反應(yīng))；

(3)擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物使用1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，使用Axygen的膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；

第二輪擴(kuò)增

100-200ng的第一輪PCR的產(chǎn)物作為該輪反應(yīng)的模板，在100μL的反應(yīng)體系中，進(jìn)行可變區(qū)基因的第二輪擴(kuò)增；PCR條件同第一輪擴(kuò)增，但反應(yīng)設(shè)置為25個(gè)循環(huán)，其中重鏈的第二輪擴(kuò)增使用帶有SfiI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的V_H-Back引物作為反向引物，以包含BstEII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的J_H-FOR引物作為正相引物；輕鏈V_κC_κ和V_λC_λ的第二輪擴(kuò)增則使用添加ApaLI和AscI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物分別作為正向、反向引物；

步驟五、初級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建：

用1.5％的瓊脂糖凝膠純化帶限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物；

將不同VH家族的PCR產(chǎn)物等量混合，使用限制性內(nèi)切酶SfiI和BstEII于50℃酶切；V_κC_κ和V_λC_λ的PCR產(chǎn)物，按輕鏈亞型混合，分別使用限制性內(nèi)切酶ApaLI和AscI于37℃酶切，酶切反應(yīng)16h；

使用Microcon-50去除酶切體系中的限制性內(nèi)切酶，同時(shí)對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽；

由1L的培養(yǎng)液中，使用質(zhì)粒大提試劑盒提取噬菌粒載體，使用SfiI和BstEII以及ApaLI和AscI酶切大約400μg的DNA，使用1％的瓊脂糖凝膠純化載體；

在100-200μL體系中，將相應(yīng)的載體1-5μg和PCR片段0.1-1.5μg室溫下，在T4DNA連接酶(9U)作用下連接16h，并使用Microcon-50對(duì)連接產(chǎn)物脫鹽；

將連接產(chǎn)物分裝成20-40ul/小管，用其電轉(zhuǎn)化100-150ul新鮮制備的TGI感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化完畢后，往電轉(zhuǎn)杯中加入1mL2TY-GLU培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5mL的EP管；用培養(yǎng)基將細(xì)胞梯度稀釋至10^-3、10^-4、10^-5和10^-6，分別取100ul涂布LB-AMP-GLU平板、9cm半徑從而測(cè)定文庫(kù)的容量；剩余的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于24*24CM的LB-AMP-GLU平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；

將平板上的菌刮下，用2TY-AMP-GLU培養(yǎng)基制成OD₆₀₀為50-100的菌懸液；添加終濃度為20％的甘油，測(cè)定OD₆₀₀并將其存放于-80℃，作為初級(jí)文庫(kù)；

步驟六、二級(jí)文庫(kù)的構(gòu)建：

將獨(dú)立的初級(jí)文庫(kù)的甘油儲(chǔ)液解凍，將不少于文庫(kù)大小10倍的菌量接種于1L的LB-AMP-GLU液體培養(yǎng)基；培養(yǎng)8-16h后，使用大提試劑盒提取質(zhì)粒；

使用限制性內(nèi)切酶SfiI和BstEII消化來(lái)源于重鏈和輕鏈文庫(kù)的質(zhì)粒DNA，重鏈可變區(qū)片段V_H使用1.5％的瓊脂糖凝膠純化，而來(lái)源于輕鏈文庫(kù)的載體使用1％瓊脂糖凝膠純化；

優(yōu)化連接和電轉(zhuǎn)化時(shí)載體與片段的比例；

擴(kuò)大連接反應(yīng)的體系，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新鮮制備的TGI感受態(tài)細(xì)胞中，產(chǎn)生最終的文庫(kù)；抗體庫(kù)按照輕鏈的亞型分成κ庫(kù)和λ庫(kù)分別保存；

步驟七、噬菌體的制備：

使用稀釋不同倍數(shù)的M13K07、VCSM13噬菌體感染指數(shù)生長(zhǎng)期的TG1細(xì)菌，37℃，培養(yǎng)30min，接種于2TY平板頂層；

取一個(gè)噬菌斑，重懸于3mL的2TY培養(yǎng)基中，添加30μL過(guò)夜培養(yǎng)的TGI，37℃，培養(yǎng)2h；

用1L的2TY培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，培養(yǎng)1h，隨后添加終濃度為50μg/mL的卡拉霉素，37℃，培養(yǎng)16h；

5000g、離心10min，去除細(xì)胞，通過(guò)往上清中添加0.25體積的噬菌體沉淀劑，沉淀噬菌體，在冰上放置30min后，5000g，離心10min收集噬菌體顆粒，用5mL的PBS重懸顆粒，并使用0.22μm的濾膜過(guò)濾；

在含有100μL?TGI的2TY頂層瓊脂平板上，測(cè)定輔助噬菌體的pfu，將噬菌體儲(chǔ)液的濃度稀釋到1×10¹³pfu/mL，分裝后存于-20℃；

在從Fab文庫(kù)中制備噬菌體前，需要將甘油菌按文庫(kù)的大小進(jìn)行混合，確保在最終的文庫(kù)中每個(gè)克隆存在不小于10個(gè)菌株，將文庫(kù)接種于ATY-AMP-GLU培養(yǎng)基中，使菌株生長(zhǎng)到指數(shù)期；

37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5-0.9，收集不少于庫(kù)容量十倍的菌體培養(yǎng)液，添加輔助噬菌體感染復(fù)性為10-20，感染的細(xì)胞37℃靜置30min，隨后搖床搖動(dòng)30min；5000g、離心10min，收集被感染的細(xì)胞，重懸于含有100μg/mL氨芐霉素和25ug/mL卡那霉素的2TY培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)16h；

從發(fā)酵液上清按步驟4培養(yǎng)中沉淀噬菌體顆粒，按50mL/L培養(yǎng)基的比例重懸噬菌體顆粒于PBS中，5000g，離心10min，去除細(xì)胞碎片；采用第二個(gè)聚乙二醇沉淀，去除未連接到噬菌體顆粒上的抗體片段；按5mL/L培養(yǎng)基的比例用PBS重懸顆粒，離心，使用0.45um濾膜過(guò)濾；添加等量的甘油，將噬菌體懸液存于-80℃；

用50％甘油/PBS溶液調(diào)整噬菌體儲(chǔ)液的濃度，使其達(dá)到10¹³轉(zhuǎn)染單位/mL；將儲(chǔ)液以每管1mL的量分裝，存于-80℃；每輪篩選使用一管；通過(guò)聚乙二醇沉淀的方法去除甘油，將噬菌體重懸于1mL后期篩選所需使用的緩沖液中。