[發明專利]通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus amyloliquefaciens 2，3-丁二醇產量

有效

• 申請號: 201310342415.2
• 申請日: 2013-08-08
• 公開（公告）號: CN103602624A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 饒志明;楊套偉;張顯;徐美娟;滿在偉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P7/18;C12R1/07
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus?amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇產量，屬于基因工程技術領域。?

背景技術

隨著能源資源的日益短缺和環境問題的日益嚴重，開發可再生的生物質資源為原料，經過化學、生物及其集成方法生產各種化學品、功能材料和能源物質的生物煉制技術越來越受到國內外的高度重視。2，3-丁二醇是重要的化工原料和液體燃料，廣泛應用于化工、食品、燃料及航空航天等領域。2，3-丁二醇脫氫生成雙乙酰，是一種高價值食品風味劑，具有一定的抑菌效果；在脫氫酶的作用下，生成的3-羥基-2-丁酮(乙偶姻)是一種應用廣泛的天然食用香料；脫水生成的甲乙酮可作為一種高價值的液體燃料添加劑，亦是重要的低沸點溶劑，應用于涂料、粘結劑、潤滑劑、燃料、油墨等行業；脫水生成的1，3-丁二烯可用于合成橡膠、ABS樹脂及SBS彈性體等；酯化產品是合成聚酯和聚氨酯的前體。而且2，3-丁二醇是一種極具價值的液體燃料，其燃燒值與甲醇(22.1kJ／g)、乙醇(29.0kJ／g)相當。由于2，3-丁二醇的高辛烷值，它可作為汽油的辛烷值提升劑或航空燃料另外，2，3-丁二醇及其衍生物亦可廣泛用于藥用載體、增塑劑、柔軟劑等的生產。?

近年來用糖質原料發酵生產2，3-丁二醇取得了較好的實驗室研究結果，但生物法生產2，3-丁二醇尚未實現工業化。目前報道的2，3-丁二醇生產菌株多為克雷伯氏菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)等，這些菌種具有潛在致病性，不符合符合工業化安全生產的要求。因此，使用安全菌種利用葡萄糖發酵生產2，3-丁二醇具有良好的工業化前景。本發明人在前期研究中篩選得到一株安全菌株Bacillus?amyloliquefaciens，該菌具有良好的2，3-丁二醇生產潛力，但是發酵過程中積累較多的副產物如3-羥基-2-丁酮、乳酸和丁二酸等。葡萄糖代謝合成2，3-丁二醇的過程也是一個氧化還原反應，該反應途徑中需要輔酶NADH和NAD⁺的參與。葡萄糖首先經過EMP途徑生產丙酮酸，此途徑中的關鍵酶3-磷酸甘油醛脫氫酶氧化3-磷酸甘油醛合成磷酸烯醇式丙酮酸，需要氧化型輔酶NAD⁺的參與；隨后丙酮酸經過三個關鍵酶催化合成2，3-丁二醇，而2，3-丁二醇的合成最后一步是乙偶姻還原酶催化還原乙偶姻合成2，3-丁二醇，此反應需要還原型輔酶NADH的參與。3-磷酸甘油醛脫氫酶和乙偶姻還原酶組成一個輔酶循環再生體系。為進一步提高該菌株2，3-丁二醇合成能力，并減少副產物的積累，發明人提出了一種通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus?amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。?

發明內容

本發明的目的是提供一種通過加強輔酶循環再生速率提高Bacillus?amyloliquefaciens合成2，3-丁二醇能力的方法。?

本發明所使用菌種為Bacillus?amyloliquefaciens?B10-127(已保藏于中國典型培養物保藏中心；保藏單位地址：中國.武漢.武漢大學；保藏日期：2012年9月14日；保藏編號為：?CCTCC?NO：M2012349)。本發明首先從解淀粉芽孢桿菌(Bacillus?amyloliquefaciens)B10-127中克隆出參與2，3-丁二醇合成途徑中輔酶循環再生的關鍵酶基因3-磷酸甘油醛脫氫酶(gapdh)和3-羥基-2-丁酮還原酶(acr)，并將該基因與穿梭表達質粒pMA5-HpaII連接，成功構建了攜帶基因gapA和acr基因的穿梭表達質粒pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh，并轉入解淀粉芽孢桿菌B10-127中，獲得加強gapdh和acr基因表達的解淀粉芽孢桿菌pMA5-HpaII-acr-HapII-gapdh／B.amyloliquefaciens(重新命名為pAG)。并對原始菌及重組菌pAG進行2，3-丁二醇發酵性能檢測，說明加強gapdh和acr基因的表達能夠提高2，3-丁二醇產量，降低副產物如3-羥基-2-丁酮、乳酸和丁二酸的積累。?