[發(fā)明專利]一種基于上轉換發(fā)光物質檢測生物分子的方法及實施其的檢測系統(tǒng)

有效

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• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN104345048A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設計）人: 楊曉林;孫旭東;劉紅
• 申請（專利權）人: 楊曉林;孫旭東;劉紅
• 主分類號: G01N21/63
• 分類號: G01N21/63;C12Q1/68;C12M1/42
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 曹津燕;張偉

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及生物分子的高靈敏度定量或定性檢測。?

背景技術

以免疫檢測和基因分析為代表的生物分子標記檢測技術，作為現(xiàn)代生物技術的重要組成部分，不僅在當今生物醫(yī)學研究領域內得到了廣泛的應用，而且已經在臨床診斷、環(huán)境衛(wèi)生檢測、食品安全、法醫(yī)鑒定等諸多部門中成為必備的常規(guī)技術手段，發(fā)揮著不可替代的作用。作為其中關鍵的標記物及其相應的信號檢測手段，迄今已經歷了以下幾個主要的技術發(fā)展階段：?

1.放射性標記：在上世紀上中葉出現(xiàn)并奠定了現(xiàn)代標記生物檢測技術的發(fā)展基礎，具有里程碑式的意義，因而獲得過諾貝爾獎。由于其具有高靈敏、高準確性、可在活體生物組織細胞內示蹤的巨大優(yōu)勢，因而被迅速應用到各個相關領域，并獲得了長足的發(fā)展。但同時也存在諸多明顯的缺點，如：某些放射性同位素由于半衰期短，不利于貯存和運輸；放射性物質的污染對工作人員的健康及環(huán)境造成一定危害，需要特殊的防護及廢物處理設備；某些應用中該方法的靈敏度也顯不足等。因此，從上世紀末開始，其市場占有率迅速下降，目前已經基本退出主流應用領域。?

2.顯色標記：分為酶標記顯色、膠體金、含色微粒等幾類，上世紀下半葉出現(xiàn)，開創(chuàng)了非放射性標記生物檢測技術的嶄新領域。具有非放射性、可肉眼觀測、無半衰期限制等優(yōu)勢，因此應用范圍很廣，特別是在床邊個體檢測（POCT）領域獲得了廣泛的市場。其缺點是靈敏度稍差、準確性和線性范圍不足，因此無法進行準確的定量檢測，只能應用于定性或半定量檢測中。?

3.熒光標記：上世紀下半葉出現(xiàn)，開創(chuàng)了非放射性活體生物組織細胞內示蹤的嶄新領域。特別是由于綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)和應用，實現(xiàn)了生物分子及其相互作用在活體生物組織細胞內的在線成像，因此獲得了本世紀初的諾貝爾獎。其應用范圍幾乎覆蓋所有生物醫(yī)學領域，是當前最重要的?生命科學研究工具之一。但由于各種實驗材料和生物體本身存在一定的本底熒光，加上短波激發(fā)光散射嚴重干擾檢測器，因此測量中需要在激發(fā)和測量部分均必須使用濾光或分光系統(tǒng)；而且由于通常采用紫外線等短波激發(fā)光，很容易導致熒光漂白、淬滅、光解和細胞損傷，因此無法進行長時間在線觀測。上述這些因素導致其靈敏度較差、準確性和線性范圍也稍顯不足。?

4.化學發(fā)光標記：上世紀末出現(xiàn)，開創(chuàng)了生物分子非放射性高靈敏度、寬線性范圍定量測定的全新領域。它不僅具有簡便、快速、安全、有效期長的特點,而且具有超過同位素標記技術的靈敏度。因此短短十幾年中，該技術在免疫學檢測、分子雜交等諸方面得到了越來越廣泛的應用，并已經成為臨床實驗診斷領域內的主流應用技術。但其缺點是信號時間穩(wěn)定性較差，難以進行重復測量；且在活體生物組織細胞內應用的范圍遠不及熒光標記技術。?

5.時間分辨熒光：上世紀末出現(xiàn)，以稀土離子絡合物作為標記物，利用其具有的延遲熒光特性，通過脈沖激發(fā)、延遲測量方式成功地降低了背景熒光噪聲，提高了靈敏度，同時還具有可重復測量的優(yōu)勢，因而被迅速應用到臨床檢驗領域，并獲得了長足的發(fā)展。但同時也存在諸多明顯的缺點，如：采用延遲測量導致信號衰減，犧牲了一定的靈敏度；環(huán)境及樣品中同類元素導致的本底可能會干擾信號的準確性。同時，所采用的流動池測量方式容易產生交叉污染和干擾測定的氣泡，沖洗過程也降低了檢測效率。另外，目前尚不能應用于活體生物組織細胞內示蹤。?

6.電化學發(fā)光：上世紀下半葉出現(xiàn)，利用鉑族金屬釕的有機化合物作為標記物，通過電極上的電化學反應氧化該標記物而發(fā)光。該技術大大降低了背景噪聲，提高了靈敏度，且具有可重復測量的優(yōu)勢，因而也被迅速應用到臨床檢驗領域。但其缺點為流動池易產生交叉污染和干擾測定的氣泡，沖洗過程降低檢測效率；同時也無法應用于活體生物組織細胞內示蹤。?

7.多光子激發(fā)上轉換發(fā)光：本世紀初出現(xiàn)，其原理是：某些摻雜稀土離子的物質以及少數(shù)不對稱有機化合物可通過多能級電子躍遷多次吸收長波激發(fā)光的能量，而在回到基態(tài)時發(fā)射出比激發(fā)光能量更強（即波長更短）的光。該發(fā)光過程顛覆了斯托克斯定律（認為物質只能受高能量光激發(fā)而發(fā)出低能量光，即波長短頻率高的光激發(fā)出波長長頻率低的光），因此也被稱為反-斯托克斯（Anti-Stokes）發(fā)光或上轉換發(fā)光。?