[發明專利]一種水稻花藥愈傷組織的培養方法

無效

• 申請號: 201310340819.8
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103355175A
• 公開（公告）日: 2013-10-23
• 發明（設計）人: 汪慶;馮都華;鄧麗;傅俊杰;舒慶堯;崔海瑞;黃建中;吳忠明;孫曉強;呂曉亮
• 申請（專利權）人: 無錫求是生物農業有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明涉及植物花藥離體培養技術領域，尤其涉及一種水稻花藥愈傷組織的培養方法。

背景技術

花藥培養是通過植物組織培養技術，將發育到一定階段的花藥，通過無菌操作技術，接種在人工培養基上，以改變花藥內花粉粒的發育程序，誘導其分化，并連續進行有絲分裂，形成細胞團，進而形成一團無分化的薄壁組織-愈傷組織，或分化成胚狀體，隨后誘使愈傷組織分化成完整的植株。

在我國，水稻花藥培養技術主要應用于三個方面：第一，將花培技術（花藥培養技術）與常規品種間雜交育種相結合，進行新品種的培育，該方面已經取得了顯著的成績。第二，將花培技術用于秈、粳亞種間雜交育種，這方面育成的品種比較多。第三，將花培技術用于雜交水稻提純復壯，用花藥提純更新不育系、保持系，其產量比對照增產10％。目前，將花藥得到的植株用于育種的理論基礎已經建立，水稻已經成為可利用花藥培養技術快速育種的作物。

在水稻的花藥培養中，以單核靠邊期的花粉對誘導單倍體植株較為適宜，此時期對花藥進行培養，誘導效率高，而花粉是否處于單核靠邊期可通過一些形態指標進行判斷和鑒定，如葉枕距、水稻穎殼顏色、雄蕊長度等。

取花藥是水稻花藥培養的第一步也是非常重要的步驟，花藥作為組織培養的原材料，在取花藥時，應可能避免對花藥造成傷害，以免影響誘導效率，同時還需盡量減少污染的幾率，此外還應考慮實驗操作的便捷性。目前，在取花藥時，通常先將稻穗進行消毒，消毒后，在超凈工作臺中，通過眼科剪將稻穗的穎殼剪開，取出花藥后眼科鑷將其接種到培養基中進行培養。該方法存在以下問題：（1）操作繁瑣且難度高，勞動強度大，費工費時，不易規模化進行生產操作；（2）在操作過程中鑷子（剪刀不會接觸培養基的）等器具直接接觸花藥或培養基，容易造成接觸污染，引入雜菌，污染培養基，同時也極易對花藥造成損傷，影響愈傷組織誘導率。

除了水稻花藥收集難度較大的問題外，在水稻花藥的離體培養中，還存在著愈傷組織誘導率低下的問題，而誘導培養基是愈傷組織形成的關鍵因素，目前針對培養基已經做出了大量的研究，如向珣朝、張楷正等（向珣朝、張楷正等，影響水稻秈粳亞種間雜交構建回交自交系的花藥培養效果的2個因素.植物生理學通訊，2006，42（6）：1041-1044）探討了N₆、SK₃通用培養基對花藥出愈率的影響，愈傷組織的出愈率約為8%左右，仍然比較低。

發明內容

為克服上述缺陷，本發明提供了一種水稻花藥愈傷組織的培養方法，花藥收集方便、收集效率高，愈傷組織的誘導率高且降低了污染幾率。

一種水稻花藥的離體培養方法，包括：

（1）取稻穗，消毒后去除穎殼的頂端；

（2）將稻苞莖稈朝上，穗部朝下使穗部懸置于盛有培養液的收集瓶內進行振蕩處理；振蕩結束后將收集瓶轉移，黑暗條件下進行誘導培養，得到水稻花藥愈傷組織；

所述培養液的配方為：SK₃基本培養基中含有2.5～3g/L脯氨酸、0.4～0.6g/L谷氨酸、1.8～2.5mg/L?2-4D和1.8～2.5mg/L?NAA。

由于水稻的花藥被穎殼包裹，將穎殼的頂端去除，即為花藥的釋放提供了通道，通過振蕩，花藥可在重力的作用下落入收集瓶內。

去除穎殼的頂端時，可采用剪除或切除的方法。

SK₃基本培養基為花藥愈傷組織培養的一種基礎培養基，主要由SK₃大量、SK₃微量、SK₃有機、鐵鹽、麥芽糖、蔗糖等組成，瓊脂的有無可分別制成固體或者液體培養基，SK3基本培養基可采用常規的方法進行配置或者購買，本發明除了在SK3基本培養基的基礎上添加激素2-4D、NAA外，還增加了谷氨酸和脯氨酸作為培養基的補充養分，并合理控制其用量，谷氨酸和脯氨酸能夠提高愈傷組織的抗性，增加愈傷組織成活率，從而提高愈傷組織的誘導率。優選的，所述脯氨酸在培養液中的濃度為2.8g/L，谷氨酸在培養液中的濃度為0.5g/L，2-4D在培養液中的濃度為2g/L，NAA在培養液中的濃度為2g/L。

稻苞抽出的劍葉葉枕到第2葉，穎殼出現淺綠色時從所述的稻苞中取出稻穗。此時，水稻的花粉處于單核靠邊期，該時期取水稻的花藥進行離體培養，愈傷組織誘導率高。

消毒前，將所述的稻穗于4℃放置4～6天。適當的低溫預處理可抑制花藥壁的退化及褐變，促使花藥脫分化形成愈傷組織。