[發明專利]一種卷煙煙氣致細胞DNA損傷的定量評價方法

有效

• 申請號: 201310340682.6
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103399159A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 陳歡;付立偉;田永峰;韓書磊;劉彤;侯宏衛;邢軍;胡清源
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種卷煙煙氣致細胞DNA損傷的定量評價方法，其特征在于：是基于量子點標記熒光免疫法對煙氣誘導的細胞DNA損傷標志物磷酸化的組蛋白（?H2AX）的定量測定方法；具體步驟如下：

1)?、細胞培養：人肺癌細胞A549細胞株培養于以1640培養基為溶劑的細胞培養基中，然后將細胞置于37℃，5％C0₂培養箱中培養，當細胞匯合率達70%-80%時，用0.25％胰蛋白酶消化法進行細胞接種；96?孔板的最外周36?個孔中每孔加入100?μl?生長培養液作為空白對照，其余每孔加入100?μl?細胞懸液，最終細胞接種密度為5000個/孔，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養24?h；

2)、細胞染毒：使用細胞培養基將煙氣總粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液調整到不同濃度，設置7個非零濃度，細胞培養24?h?后，吸去培養液，96?孔板（除最外周36?孔）每列6?孔為一組，分別設置7?個不同濃度的煙氣染毒組和空白對照組處理，煙氣染毒組每孔加入100?μl不同濃度梯度的煙氣粒相物萃取液或煙氣氣相物吸收液，96?孔板的最外周36?個孔中每孔加入100?μl?稀釋培養液作為空白對照，于37?℃、5%?CO₂?條件下培養24?h；

3)、基于量子點標記熒光免疫法對細胞中?H2AX定量測定：(1)細胞固定：細胞染毒24?h后，小心移去培養基，用Tris緩沖液洗滌兩次，每次至少5?min，以除去化合物染毒溶液，采用1%中性甲醛固定細胞；(2)固定好的A549細胞用Tris緩沖液洗滌2次，加入通透液室溫孵育20?min；(3)?Tris緩沖液洗滌3次，滴加2%?BSA封閉液，在37℃濕盒中孵育30min；(4)?加入100?μl含有兔抗人H2AX抗體和小鼠抗人?H2AX抗體組成的一抗混合液，在37?℃恒溫培養箱中孵育2小時或4?℃過夜；(5)Tris緩沖液洗滌3次，加入量子點標記混合二抗溶液，在37?℃恒溫培育2小時；(6)?向微孔板中加入100?μL的Tris緩沖液，經熒光酶標儀（405nm處激發，在525nm和605nm處檢測）測定熒光強度值；

4)、數據處理：試驗中設置空白對照組，即不加入一抗抗體，僅加入量子點標記的二抗抗體，所檢測信號即為由非特異性吸附引起的空白信號；所有樣品測試孔的檢測信號應扣除空白信號；最后，根據目標物?H2AX與總H2AX含量的比值和化合物染毒濃度繪制劑量效應曲線。

2.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述細胞培養基的配制方法為：溶劑為RPMI-1640?培養基，其中胎牛血清的體積百分比為10%，L-谷氨酰胺的濃度為2?mM，青霉素的濃度為100?IU/ml，鏈霉素的濃度為100μg/ml。

3.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述1%中性甲醛溶液的配制方法為：通過4mL的?40%甲醛和96mL的Tris緩沖液配制。

4.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述Tris緩沖液的配制方法為：1.21g三羥基氨基甲烷和7.6g氯化鈉加入到900mL蒸餾水中，用濃鹽酸調節pH值至7.4，定容止1000mL。

5.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述細胞膜通透液為濃度0.3%?Triton?X-100液，配制方法：取0.3?ml?Triton?X-100，加入至100?ml的?Tris緩沖液中，充分混勻后使用。

6.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述封閉液為濃度2%牛血清白蛋白（BSA），配制方法：取2g的BSA用Tris緩沖液充分溶解，定容至100mL。

7.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述混合一抗溶液的配制方法為：使用前取適量兔抗H2AX抗體和小鼠抗?H2AX抗體混合，用2%?BSA封閉液稀釋至所需濃度。

8.根據權利要求1所述的定量評價方法，其特征在于：所述量子點標記混合二抗溶液配制方法為：使用前取適量QD?605?nm-羊抗鼠IgG和QD?525?nm-羊抗兔IgG混合，用2%?BSA封閉液稀釋至所需濃度。