[發(fā)明專利]一種用于檢測組蛋白甲基化的信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310340157.4
• 申請日: 2013-08-07
• 公開（公告）號: CN103389382A
• 公開（公告）日: 2013-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾令文;葛晨晨;余路新;方志遠(yuǎn)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于檢測組蛋白甲基化的試紙條生物傳感器，特別是涉及一種用于檢測HeLa細(xì)胞中組蛋白H3K9三甲基化（H3K9me3）的信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器。

背景技術(shù)

組蛋白是指在所有真核生物的細(xì)胞核中與DNA結(jié)合存在的堿性蛋白質(zhì)的總稱。組蛋白有五種類型，包括H1、H2A、H2B、H3、H4，能夠同DNA中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用。在真核細(xì)胞中，染色體是由重復(fù)單位──核小體組成。每一核小體包括一個(gè)核心組蛋白8聚體（由H2A、H2B、H3和H4的各兩個(gè)單體組成）、長度約為200個(gè)堿基對的脫氧核糖核酸（DNA）和一個(gè)單體組蛋白H1。核小體通過DNA或組蛋白的修飾來攜帶表觀遺傳學(xué)信息，例如DNA甲基化、組蛋白甲基化、磷酸化、乙酰化、SUMO化和泛素化。并且，核心組蛋白的N端會從核小體的核伸出，組蛋白的共價(jià)修飾就經(jīng)常發(fā)生在N末端的賴氨酸（K）或精氨酸（R）上。賴氨酸側(cè)鏈可以被單甲基化（me1）、二甲基化（me2）或三甲基化（me3），精氨酸側(cè)鏈可被單甲基化或二甲基化。細(xì)胞的染色質(zhì)中不同類型的組蛋白甲基化具有不同的意義。例如H3K4me1和H3K4me3常見于常染色質(zhì)，與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，H3K9me2和H3K9me3常見于異染色質(zhì)，與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，H3K9的三甲基化水平不僅在構(gòu)建和維持異染色質(zhì)穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用，而且與很多細(xì)胞中重要的生物學(xué)事件相關(guān)，例如細(xì)胞衰老、腫瘤再生、決定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向等。

????目前，Western?blot是用于分析細(xì)胞中組蛋白H3K9三甲基化水平的常用的方法，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。但是，該方法的操作時(shí)間較長（約一天），步驟繁瑣，需要多種昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作人員，并且使用的試劑毒性很大。因此，研發(fā)一種簡便快速用于組蛋白H3K9me3的檢測方法及相關(guān)裝置是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測組蛋白甲基化的信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器，可簡便、快速地檢測組蛋白甲基化狀況，且通過增強(qiáng)探針使檢測信號進(jìn)一步放大，適用于有關(guān)疾病的診斷及治療。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明所述的用于檢測組蛋白甲基化的信號增強(qiáng)的試紙條生物傳感器，所述試紙條生物傳感器包括：具有粘性的底板；硝酸纖維素膜，粘貼在所述底板的中部；所述硝酸纖維素膜上噴有抗組蛋白H3的單克隆抗體和羊抗鼠的IgG抗體，分別形成檢測線和質(zhì)控線；金標(biāo)墊，粘貼在所述硝酸纖維素膜的一側(cè)的底板上，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜之間有2-3mm的重疊；所述金標(biāo)墊上噴有c-DNA與抗組蛋白H3的單克隆抗體雙標(biāo)的金納米顆粒溶液；吸水紙，粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一側(cè)的底板上，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2-3mm的重疊；樣品墊，粘貼在所述底板上，所述樣品墊與所述金標(biāo)墊之間有2-3mm的重疊；檢測時(shí)，所述樣品墊上先滴加組蛋白提取液，然后滴加由DNA與金納米顆粒偶聯(lián)形成的增強(qiáng)探針。

所述DNA的序列為SEQ?ID?NO.1，優(yōu)選地，所述DNA是巰基修飾的。

DNA的5’端標(biāo)記巰基，其序列為：

5’-SH-atcataagctcatacaatcactaa-3’（SEQ?ID?NO.1）。

所述c-DNA的序列是與所述DNA的序列互補(bǔ)的，優(yōu)選地，所述c-DNA是生物素修飾的。

c-DNA的5’端標(biāo)記生物素（biotin），其序列為：

5’-biotin-ttagtgattgtatgagcttatgat-3’。

根據(jù)本發(fā)明所述的試紙條生物傳感器的進(jìn)一步特征，所述樣品墊是如下制作的：將玻璃纖維浸泡在含有1%?BSA、2%?Triton、2%?PEG4000、20?mM?Tris-Ac和50?mM?NaAc的溶液中，晾干后形成所述的樣品墊。

根據(jù)本發(fā)明所述的試紙條生物傳感器的進(jìn)一步特征，所述的試紙條生物傳感器是用于檢測HeLa細(xì)胞中組蛋白H3K9三甲基化的。

????本發(fā)明的優(yōu)勢是：

1）本發(fā)明中使用試紙條法檢測H3K9me3，簡便快速，實(shí)驗(yàn)結(jié)果在15分鐘內(nèi)用肉眼就能觀察到，從而避免了western?blot的操作步驟復(fù)雜，操作時(shí)間長等缺點(diǎn)。

2）本發(fā)明中引入了一個(gè)用于增強(qiáng)TZ和CZ顯色的增強(qiáng)探針AuNP-DNA，可以使檢測信號進(jìn)一步放大。

3）本發(fā)明所述的試紙條生物傳感器具有很高的靈敏度，在0.02ug的HeLa細(xì)胞組蛋白提取液中就能檢測到H3K9me3，比傳統(tǒng)的試紙條和western?blot的靈敏度分別提高了10倍和15倍。