[發明專利]3’，5’-二磷酸腺苷酸特異性3’-核苷酸酶及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201310339369.0
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103451165A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 孫梅好;楊洋;李珍珍;馬建輝
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/70;C12Q1/34
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.3’，5’-二磷酸腺苷酸特異性3’-核苷酸酶，其為以下（a）或（b）的蛋白質：

（a）由SEQ?ID：NO.5所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

（b）在（a）的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有3’，5’-二磷酸腺苷酸特異性3’-核苷酸酶活性的由（a）衍生的蛋白質。

2.根據權利要求1所述的3’，5’-二磷酸腺苷酸特異性3’-核苷酸酶，其特征在于：（b）的氨基酸序列為SEQ?ID：NO.6?、SEQ?ID：NO.7或SEQ?ID：NO.8所示。

3.編碼權利要求1或2所述的蛋白質的基因。

4.根據權利要求3所述的基因，其特征在于：該基因的核苷酸序列為SEQ?ID：NO.1、SEQ?ID：NO.2?、SEQ?ID：NO.3或SEQ?ID：NO.4所示的DNA分子。

5.一種構建權利要求1所述的3’，5’-二磷酸腺苷酸特異性3’-核苷酸酶的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）PCR法克隆的YND核苷酸序列和pET24a原核蛋白超表達載體，分別經限制性內切酶Nde?I/Hind?III雙酶切后，利用T4連接酶連接構建表達載體pYND，用于表達YND；

2）利用PCR突變的方法獲得DNA：根據YND基因的序列與所要突變的位點，設計定點突變PCR引物，以突變位點為中心，左右各取10-15個堿基，引物長度為25-45個堿基；

3)所獲DNA轉化E.?coli?DH5α?感受態細胞擴增質粒并測序驗證；

4)將突變質粒轉化E.?coli?BL21，接種過夜培養的菌液于液體培養基中培養,收集菌體；

5）取裂解液，懸浮菌體，混合均勻后，冰浴超聲波破碎菌體，離心收集上清；

6）利用PAP瓊脂糖凝膠純化YND及其突變蛋白。

6.根據權利要求5所示的構建方法，其特征在于突變PCR引物的序列如下：

引物名稱?引物序列（5’-3’）

G236A1:CATGATTACTTTAGAGGCAGTTGAAAAGGGACACTC

G236A2:GAGTGTCCCTTTTCAACTGCCTCTAAAGTAATCATG

G236C1:CATGATTACTTTAGAGTGCGTTGAAAAGGGACACTC

G236C2:GAGTGTCCCTTTTCAACGCACTCTAAAGTAATCATG

G236V1:CATGATTACTTTAGAGGTCGTTGAAAAGGGACACTC

G236V2:GAGTGTCCCTTTTCAACGACCTCTAAAGTAATCATG

G236S1:CATGATTACTTTAGAGAGCGTTGAAAAGGGACACTC

G236S2:GAGTGTCCCTTTTCAACGCTCTCTAAAGTAATCATG。

7.權利要求1或2所述特異性3’-核苷酸酶的應用，其特征在于：所述的特異性3’-核苷酸酶用于3’，5’二磷酸腺苷的檢測。