[發明專利]含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒、含該表達盒的微環DNA及應用

在審

• 申請號: 201310339305.0
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN104342453A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 陳志英;馬飛;何成宜
• 申請（專利權）人: 深圳先進技術研究院;深圳市合一康生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/11;C12N15/10;A61K48/00;C07K16/18;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;熊永強

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒及其構建方法和應用，和一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA及其構建方法和應用，一種具有含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA的宿主細胞及其應用，以及一種基因工程抗體及其表達方法和應用。

背景技術

臨床上，重組抗體已被用來治療各種疾病，包括癌癥和自身免疫性疾病等。但是目前基因工程抗體一般是在體外生產后再注射到體內進行治療，這種方式有多種缺點，比如：（1）生產、包裝、運輸、保存等環節花費大、成本高；（2）蛋白抗體藥物純度不高，污染物存在副作用，有安全隱患；（3）抗體的半衰期短，需反復注射，有時還需要用微泵給藥法維持體內抗體的有效濃度，加大了抗體臨床應用的難度，且治療費用高昂。

基因治療采用基因轉染的方式將治療性基因轉染到人體靶細胞，是避免直接注射蛋白抗體藥物存在的問題的有效途徑之一。在基因治療中，采用有效的載體高效、安全地將目的基因轉移至宿主細胞內表達非常重要，在臨床應用的基因治療載體中，主要有重組腺病毒載體、逆轉錄病毒載體和質粒載體。其中，病毒載體在體內的轉染率高，但制備病毒載體的費用高昂，且病毒載體存在插入突變的風險和免疫原性，會帶來誘癌風險并可能引發患者致命的免疫反應。傳統的質粒載體比病毒載體安全，但比病毒載體的轉染率低，且外源基因只能瞬時表達，如要穩定持久地表達，載體必須整合到宿主細胞染色體上，而載體的隨機整合會引起插入突變或導致外源基因的沉默，此外，傳統質粒載體中含有細菌復制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隱藏的表達信號，這些序列在質粒復制時是必需的，但在基因治療中可能引起嚴重的生物安全性問題。

發明內容

鑒于此，本發明實施例第一方面提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，該微環DNA母質粒能在宿主菌內完成微環DNA的重組過程，消除原核質粒元件。

本發明實施例第二方面提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒的構建方法。

本發明實施例第三方面提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA，該微環DNA可游離于宿主細胞基因組DNA之外穩定持久的表達基因工程抗體基因。

本發明實施例第四方面提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA的構建方法。

本發明實施例第五方面提供了一種具有含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA的宿主細胞。

本發明實施例第六方面提供了一種基因工程抗體。

本發明實施例第七方面提供了一種基因工程抗體的表達方法。

本發明實施例第八方面提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒、含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA、具有含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA的宿主細胞和基因工程抗體的應用。

第一方面，本發明提供了一種含基因工程抗體基因表達盒的微環DNA重組母質粒，所述微環DNA重組母質粒是在微環DNA空質粒的多克隆位點（MCS）中插入基因工程抗體基因表達盒的基因序列組合而成，其中，所述微環DNA空質粒為p2ФC31質?；騪MC.BESPX質粒，所述基因工程抗體基因表達盒包括依次連接的啟動子、編碼免疫球蛋白κ鏈信號肽的堿基序列、編碼Flag標簽的堿基序列、基因工程抗體基因、編碼組氨酸His6標簽的堿基序列、終止密碼子和polyA加尾信號。

優選地，所述基因工程抗體基因具有編碼基因工程抗體的堿基序列，所述基因工程抗體為雙靶向特異性抗體，所述雙靶向特異性抗體具有靶向免疫效應細胞抗原表位的結合位點和腫瘤細胞抗原表位的結合位點。

進一步優選地，所述免疫效應細胞選自T淋巴細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞中的一種。

進一步優選地，所述腫瘤細胞選自B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、結直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和甲狀腺癌細胞中的一種。

以上所述免疫效應細胞和所述腫瘤細胞為優選的種類，實際應用中不限于本發明所例舉的具體的上述免疫效應細胞和腫瘤細胞。

進一步優選地，所述雙靶向特異性抗體靶向結合所述腫瘤細胞的至少一個抗原表位。