[發明專利]同時檢測牛羊豬犬四種布魯氏菌的PCR試劑盒及其制備方法和使用方法

有效

• 申請號: 201310339187.3
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103409520A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王興龍;陳思;王秀然;錢晶;郎需龍;王曉旭
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 長春菁華專利商標代理事務所 22210
• 代理人: 王丹陽

1.同時檢測牛羊豬犬四種布魯氏菌的PCR試劑盒，其特征在于，

該PCR試劑盒由PCR反應液、DNA聚合酶、陽性質控標準品和陰性質控標準品組成；

所述PCR反應液包括鑒定牛種、羊種、豬種、犬種布魯氏菌的四對引物，分別為P_IS711f和P_494r，P_IS711f和P_732r，P_591f和P_591r，P_272f和P_272r：

正向引物P_IS711f：5′-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′，

反向引物P_494r：5′-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′，

反向引物P_732r：5′-AAATCGCGTCCTTGCTGGTCTGA-3′，

正向引物P_591f：5′-CTGGTGGGTATCGCATTACTCGG-3′，

反向引物P_591r：5′-TTCAGGAAAGCCTGGCGGTACTG-3′，

正向引物P_272f：5′-GGAACACTACGCCACCTTGT-3′，

反向引物P_272r：5′-GATGGAGCAAACGCTGAAG-3′；

所述陽性質控標準品包括牛種布魯氏菌陽性質控標準品、羊種布魯氏菌陽性質控標準品、豬種布魯氏菌陽性質控標準品和犬種布魯氏菌陽性質控標準品；

所述牛種布魯氏菌陽性質控標準品由含有494個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒和含有591個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒組成，所述羊種布魯氏菌陽性質控標準品由含有732個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒和含有591個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒組成，所述豬種布魯氏菌陽性質控標準品由含有272個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒和含有591個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒組成，所述犬種布魯氏菌陽性質控標準品由含有272個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒組成；

所述含有494個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒、含有732個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒、含有591個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒和含有272個堿基的核苷酸片段構成的pMD-18T重組質粒均能在大腸桿菌DH5α感受態細胞中增殖；

所述含有494個堿基的核苷酸片段的序列為：

5′-gacgaacggaatttttccaatcccatcgtttccgtttcacttggcctgccggcaacgtttcagtttggcggaatga?aacggacggacccgatcaccaaatatatcctgcaccatggcgacgtggttgtctggggcgggccgtcgcggcttttctatc?acggtattctaccattgaagtctggcgagcatgagcggctggggccgtttcggcttaatctgaccttccgaaaggcgttcta?gggcgtgtctgcatttaacgtaaccagatcatagcgcatgcgagatggacgaaacccatgaatgcggtcaatgttttctcgc?atcgcagcgcaatacgacgatagcgtttcaacttgttaaaaaagcattcaatctgatggcgttccttgtacagcctccagtcg?attgttggggcactggaacgtgttggattgaccttgatctgagccgttgccttgagatcgctggcaatgaaggcccttaagtg?atcggca-3′，

所述含有732個堿基的核苷酸片段的序列為：

5′-tgccgatcacttaagggccttcattgccagcaatctcaaggcaacggctcagatcaaggtcaatccaacacgtt?ccagtgtcccaacaatcgactggaggctgtacaaggaacgccatcagattgaatgcttttttaacaagttgaaacgctatcgt?cgtattgcgctgcgatgcgagaaaacattgaccgcattcatgggcttcgtccatctcgcatgcgctatgatctggttacgttg?aatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagacagtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccata?cttgcaacagtgacagcgataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctattccaatctcgcta?ttgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtggattattctgagccgaaacactcctgattttttaggggtgccgc?ttgttaaggcgattcacgacaagaaacttcttatagtcgatggtgcaccatggctaagtttgggtgtcatgaccgcgatttacg?tcaaagacggtgaatatgagcggcttgtgtgcaccggagaggtagtaaacgttcagacaaataagctggttcagattcatat?ccggggttatgaagaaatttataacgatatcgaagctgttggtgaaaaacttaatcagaccagcaaggacgcgattt-3′，

所述含有591個堿基的核苷酸片段的序列為：

5′-ctggtgggtatcgcattactcggcgccctggggctgacggggctgacaagtagcggcatcggggcggtggc?tgccggcgggcttctcggttttgccctgttcaaccgcccgcctgccagcatttttctcggcgattccggaagccccccattg?gggctgatcgtaggaacagccttgctgctgcttgcgcgtgaaacacacatcgtggtcgcgcttgttctgccgctttattatatt?ctggatgcgggcaccacaattgtcatgcgtgcagcccaaggtgagaacatcctcaaggctcactcgaaacatgcctatca?gatagcaaaacgcagtggctggagtgtgccgaaagtggtggcccatgtggcgcttttaaatacaatcctgatcgcctgcgt?ggtggccttgctggcgctggatcatccgctcgcacaactgacatttctgctggtcgcagccgttgccacactcattctgctg?ctcgatttccgcgggcgcttcaggaagctatgacctcgaaaagcaccttgcggaccatttcgatatccttcttttccatggcg?gtccgcagtaccgccaggctttcctgaa-3′，

所述含有272個堿基的核苷酸片段的序列為：

5′-gatggagcaaacgctgaagcccaagcgaggccccgaaatagaccaggaagagcgtcaggagttccggca?gaccgcgaaagatggtggtgtagatattagccgcaagccgcatcgaaggttcgctggactgcttgcccagagcgaccag?aaaaccgaggatgagaccaacgggaagtgtggcgagtgccagactgacggtaacaagaagtcctttggcaatgctgata?ccccagccatcgggaccgaaactcaacaaggtggcgtagtgttcc-3′。