[發明專利]一種在黃綠光波段測量時間分辨熒光儀器響應函數的方法

在審

• 申請號: 201310338275.1
• 申請日: 2013-08-05
• 公開（公告）號: CN104345050A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發明（設計）人: 潘海峰;賈夢輝;劉夢薇;李磊;趙力濤;常孟方;張三軍;徐建華
• 申請（專利權）人: 華東師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 上海麥其知識產權代理事務所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

技術領域

本發明屬于光學光譜測量領域，涉及時間分辨熒光儀器響應函數的測量方法，尤其涉及一種在黃綠光波段測量時間分辨熒光儀器響應函數的方法。

背景技術

在時間分辨熒光光譜測量中，所測得的熒光衰減曲線實際上是儀器響應函數（Instrument?Response?Function，IRF）和理想時間衰減曲線的卷積。要獲得理想時間衰減曲線，就需要去除儀器響應函數（IRF）所帶來的影響。因此，儀器響應函數是否準確將直接影響到理想時間衰減曲線的測量準確性。通常，儀器響應函數是通過測量激發光的時域剖面圖來獲得的。瑞利光散射為這一測量提供了足夠強度的信號，可以通過測量儀器對瑞利散射的響應來獲得儀器響應函數。用這種方法獲得儀器響應函數時，存在一些缺陷，比如只能將探測波長靠近激發波長位置處進行信號探測，然而，被激發的物質發出的熒光的波長相對于激發光的波長有一定的偏移，而且測量儀器如單色儀、光電倍增管或雪崩光電二極管都存在顏色效應，這將導致用這種方法得到的儀器響應函數出現系統誤差。因此，人們期望一種新的能獲得更精確的儀器響應函數的方法。

熒光素是一種常見的具有光致熒光特性的染料，因其具備消光系數高、量子產率大、以及吸收和發射帶存在大量重疊區域等優點，作為一種單壽命的熒光染料被廣泛應用在熒光光譜領域中（ZhengH,ZhanXQ,BianQN,et?al.ChemCommun,2013,49(5):429-47，《化學通訊》；HolcovaV,SimaJ,DusekJ.Cent?Eur?J?Chem,2013,11(2):200-4，《中歐化學雜志》），被用作測量時間分辨熒光儀器響應函數的參考染料。除了熒光素，羅丹明6G(Hanley?QS,Subramaniam?V,Arndt-Jovin?DJ,et?al.Cytometry,2001,43(4):248-60《細胞計數》)和玫瑰紅(Szabelski?M,Luchowski?R,Gryczynski?Z,et?al.ChemPhysLett,2009,471(1-3):153-9，《化學物理快報》)也被用作測量時間分辨熒光儀器響應函數的參考染料。

熒光素鈉較熒光素具有更高的熒光強度和更短的熒光壽命。另外，與羅丹明6G和玫瑰紅的發射波長不同，熒光素鈉的發射波長為黃綠光波段，與生物分子中應用廣泛的綠色熒光蛋白（GFP）和黃色熒光蛋白（YFP）的發射波長范圍一致。由于在樣品發射波段來測量儀器響應函數，能提高整個實驗結果的準確性，并且可避免更換濾光片的麻煩，因此，用熒光素鈉的堿性溶液來獲得儀器響應函數（IRF）是合適的，即非常適合用作測量儀器響應函數的參考燃料。尤其對于綠色和黃色熒光蛋白的研究，使用熒光素鈉作為一種在黃綠光波段測量儀器響應函數的參考染料具有重要的參考價值。

如前所述，測量儀器測得的熒光衰減曲線是理想熒光衰減曲線和儀器響應函數的卷積。如果某種物質（熒光團）的熒光壽命非常小，以致于遠小于儀器本身的響應時間，那么，測量測得的該物質的熒光衰減曲線數據基本上就可以作為該儀器裝置的儀器響應函數，從而簡單地通過測量該被測物質的熒光衰減曲線來快速地獲得儀器響應函數。

有很多方法可以將熒光團壽命有效減小至皮秒量級，從而使其作為儀器響應函數的參考物質成為可能。碰撞淬滅(Lawrence?WG,VanMarter?TA,Nowlin?ML,et?al.J?Chem?Phys,1997,106(1):127-41《化學物理學報》)就是其中一種最簡單可行的辦法。