[發明專利]一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法

無效

• 申請號: 201310338051.0
• 申請日: 2013-08-06
• 公開（公告）號: CN103602670A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 陳秋云;趙婷婷;楊歡
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

技術領域：

本發明屬于腫瘤細胞檢測和核酸試劑制備領域，特指一種納米核酸-銀簇（DNA-AgNCs）的制備方法及其在用熒光光譜法快速檢測細胞中HIF含量的運用。

背景技術：

最近幾年，納米銀簇（AgNCs）因具有獨特的物理學、電學和光學性質，在化學傳感、生物傳感、成像及診斷等方面的應用，引起了很多的關注。鑒于納米銀易聚集不穩定的特點，用模板來合成較穩定納米銀簇的方法得到了廣泛研究，以樹枝狀大分子、小分子物質、多肽、蛋白質和DNA等為模板，成功的合成了在水中穩定的納米銀簇?(J.?Sharma,?R.?C.?Rocha,?M.?L,?Phipps,?H.C.?Yeh,?K.?A.?Balatsky,?Dung?M.?Vu,?A.?P.?Shreve,?J.?H.?Werner,?J.?S.?Martinez,?A?DNA-templated??uorescent?silver?nanocluster?with?enhanced?stability,?Nanoscale,?2012,?4,?4107–4110)。先后有以聚甲基丙烯酸、植酸鈉、雙功能絡合劑（翁建;崔強;丁家包，一種聚甲基丙烯酸微波合成熒光銀納米粒子的方法，?中國發明專利201010540810.8；楊海峰;王娜，具表面增強拉曼散射活性的菜花狀納米金-銀合金的制備方法，?中國發明專利201010133185.5；呂榮文;鄒偉;張淑芬，對含硝基的爆炸化合物高敏感檢測的銀納米簇及其制備，中國發明專利201110194650.0，）等為模板合成不同尺寸和用途銀納米粒子。由于Ag⁺和Ag與DNA上的胞嘧啶有很高的親和性，以多胞嘧啶核苷酸的DNA為模板可合成穩定、有優異的光譜和光物理性的銀簇?。DNA不僅是生命體中重要的遺傳物質，與蛋白質的翻譯和酶的形成有中要關聯，還是許多物質的目標分子，因此，基于DNA的納米銀簇（DNA-AgNCs）為探測各種疾病治療和診斷中重要的分子提供強大平臺（H.?C.?Yeh,?J.?Sharma,?I.?M.?Shih,?D.?M.?Vu,?J.?S.?Martinez,?J.?H.?Werner,??A?fluorescence?light-up?Ag?nanocluster?probe?that?discriminates?single-nucleotide?variants?by?emission?color,?J.?Am.?Chem.?Soc.,?2012,?134,?11550?11558）。?缺氧誘導因子（HIF）是激活線粒體氧化磷酸化和無氧酵解的開關，通過誘導糖酵解酶和葡萄糖轉運子基因的表達，激活和促進糖酵解過程。腫瘤細胞中HIF高表達因此，HIF成為腫瘤重要標志之一，探測腫瘤細胞HIF的變化對于腫瘤診斷和治療具有重大意義。目前HIF-1的體外檢測一般采用凝膠電泳的方法，此方法有檢測靈敏度較低,?操作復雜，周期長等缺點。因此，開發簡單快速，靈敏度高，特異性強，準確檢測細胞內HIF的分析技術仍然是一個挑戰。

發明內容：

本發明設計了一種新的脫氧核酸（DNA）序列：5’?CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’，其特點為由合成納米銀簇序列（5’CCTCCTTCCTCC3’）和與HIF有相互作用的識別序列（5’CTACGTGCT3）組成的雙功能DNA序列為5’?CCTCCTTCCTCCCTACGTGCT3’。其次以這種雙功能DNA為模板，于檸檬酸鈉緩沖溶液中，利用NaBH₄還原AgNO₃的方法，成功合成了具有熒光的核酸納米銀簇（DNA-AgNCs）。這種核酸納米銀簇（DNA-AgNCs）在激發波長為510?nm下能發射585?nm的熒光，DNA-AgNCs的熒光量子產率為34.4%（以羅丹明B為參照），納米銀簇的大小為~2?nm。?其585?nm的熒光能被DNA的互補序列(AGCACGTAG)?及HIF高表達的腫瘤細胞全蛋白淬滅，說明該核酸納米銀簇（DNA-AgNCs）是一種靈敏的熒光探針，可用于定性分析細胞全蛋白中HIF的含量，并可用于區分HIF高表達的腫瘤細胞和正常細胞。此熒光探針4℃環境中可保存大于4個月熒光未見明顯變化。

一種用于檢測缺氧誘導因子的熒光納米核酸銀的制備方法，按照下述步驟進行：