[發(fā)明專利]一種檢測肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物及其用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310337890.0
• 申請日: 2013-08-05
• 公開（公告）號: CN103397096A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 朱聰;張啟坤;趙紅霞;李興;陳歡
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/113
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種檢測肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物及其用途。

背景技術(shù)

在我國，原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，超過85%的原發(fā)性肝癌都是由于乙型或丙型肝炎病毒感染，長期酗酒和黃曲霉毒素B1攝入引起的。由于臨床缺乏有效的預(yù)防、檢測及治療手段，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬癌癥中晚期，且預(yù)后較差，死亡率高。據(jù)最新統(tǒng)計全球每年新增約75?萬肝癌患者，而每年也約有70?萬人死于肝癌，患者死亡率在所有惡性腫瘤中居第三位。在臨床檢查中，AFP?(Alpha-Fetoprotein)?作為常用的肝癌診斷的血清學(xué)標(biāo)記物，但其敏感性和特異性差強(qiáng)人意，僅70%左右的肝癌患者血清內(nèi)的AFP有明顯增高，對于直徑小于3cm的腫瘤其敏感性僅為25%，而對于直徑大于3cm的腫瘤其敏感性也只有50%。?因此，尋找一種新的更可靠的生物學(xué)標(biāo)記物用于肝癌診斷和預(yù)后判斷，具有廣泛的科研價值和臨床應(yīng)用前景。

MicroRNA?(miRNA)是一類進(jìn)化高度保守的，由20-23個核苷酸組成的非編碼RNA，miRNA的種子區(qū)通過靶向結(jié)合mRNA的3’-UTR區(qū)來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。人類約30%的蛋白表達(dá)受到miRNA的調(diào)控，許多研究表明miRNA扮演著癌基因或抑癌基因的角色，能夠同時調(diào)節(jié)多個基因，通過結(jié)合靶mRNA參與調(diào)控腫瘤生成過程。目前，不斷累積的研究成果已充分證實miRNA在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平，具有篩查和診斷肝細(xì)胞癌并對治療方案的選擇和預(yù)后分析具有潛在的指示作用。

發(fā)明內(nèi)容

?本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物及其用途。

一種檢測肝細(xì)胞癌的生物標(biāo)記物，它為一種miRNA，其序列特征為：AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU（SEQ?ID?NO：6）或者其對應(yīng)的DNA序列。

?一種所述的生物標(biāo)記物的用途，制備用于篩查肝臟腫瘤、輔助肝臟腫瘤病理鑒定、臨床診斷、篩選藥物、治療評估中的一種或多種的試劑盒。

?所述試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)和引物系統(tǒng)；

?所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)包括反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；

?所述引物系統(tǒng)由所述miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物、擴(kuò)增引物以及U6?snRNA的擴(kuò)增引物組成。

?所述試劑盒還包括擴(kuò)增系統(tǒng)；所述擴(kuò)增系統(tǒng)包括含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測混合液。

?所述試劑盒采用的檢測所述標(biāo)記物的技術(shù)為基于莖環(huán)的反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR技術(shù)。

?所述的PCR技術(shù)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)反轉(zhuǎn)錄引物，由以下核苷酸序列組成：

GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAACTCA（SEQ?ID?NO：1）。

?所述的PCR技術(shù)采用DNA染料法。

?所述的PCR引物由以下核苷酸序列組成：

miR-451?PCR正向引物：GCGCAAACCGTTACCATT（SEQ?ID?NO：4）；

miR-451?PCR反向引物：GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ?ID?NO：2）。

????在熒光定量PCR檢測方法中，使用保守性snRNA的U6?snRNA作為內(nèi)參照基因，其特異性PCR引物由以下核苷酸序列組成：

U6?PCR正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA（?SEQ?ID?NO：5），

U6?PCR反向引物：AACGCTTCACGAATTTGCGT（SEQ?ID?NO：3）。

本發(fā)明的有益效果為：（1）本發(fā)明確定的miRNA與肝癌臨床病例指標(biāo)的密切相關(guān)性，能夠作為生物標(biāo)記物對肝癌患者進(jìn)行篩查和診斷，為臨床個體化干預(yù)治療提供有效依據(jù)。（2）通過實時熒光定量PCR技術(shù)對肝癌患者組織中的miRNA的檢測，定量準(zhǔn)確。相對于芯片技術(shù)或者分子雜交，該方法簡便快速且經(jīng)濟(jì)實用。（3）由于本發(fā)明針對的是腫瘤組織中的miRNA，相比血清學(xué)生物標(biāo)記物更具有特異性、穩(wěn)定性和敏感性，因此組織miRNA可輔助肝臟腫瘤的篩查和診斷，進(jìn)而提高治愈率和降低死亡率。（4）可與其他分子指標(biāo)相結(jié)合，為肝臟腫瘤篩查、診斷、治療與預(yù)后提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應(yīng)用。

附圖說明

?下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

?圖1是miR-451在肝癌組織樣本與正常肝組織樣本中相對表達(dá)差異倍數(shù)。