[發明專利]抗牛支原體的單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株及應用

有效

• 申請號: 201310336959.8
• 申請日: 2013-08-05
• 公開（公告）號: CN103436496A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 辛九慶;劉洋;李媛;汪洋
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/00;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種對牛支原體有特異性的單克隆抗體，產生所述單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其制備方法和應用。屬于疾病診斷和檢測領域。

背景技術

支原體（Mycoplasma），又稱霉形體，是目前已知的能在人工培養基中生長的最小原核微生物。支原體無細胞壁，細胞形態多形化；能夠通過0.22μm的細菌濾器(Nicholas&Ayling,2003)。其基因組小，GC含量僅為27.8mol%-32.9mol%，生物合成及代謝能力低下。對青霉素等作用于細菌胞壁的抗生素有抵抗力。支原體在自然界中廣泛存在，主要分布于污水、土壤、動植物和人體內。支原體最早于1700年在患有傳染性胸膜肺炎的牛中發現，直到1898年法國科學家RouX和Nocard用含有動物血清的人工培養基首次分離成功，并將其命名為胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonia?Organism，PPO)。此后，不斷有新的類似的微生物被分離出來，統稱為類胸膜肺炎微生物（Pleuropneumonsa?like?organism，PPLO)。1967年，國際細菌命名委員會正式將這類微生物命名為支原體，并一直沿用至今。早期的支原體研究受限于培養條件，研究進展一直很緩慢。直至1962年，Hayflick采用無細胞的支原體培養基成功分離到肺炎支原體后，支原體的研究才逐漸取得極大進展。迄今為止，人們已經分離到190多種支原體，許多能夠引起動植物多種疾病。

牛支原體（Mycoplasma?bovis，M.bovis）在分類上屬于支原體屬，同其他支原體一樣，牛支原體具有體型微小，基因組成分微量等特征(Caswell&Archambault,2007)。普通光學顯微鏡不能觀察到牛支原體，只有在電鏡下才能觀察到其外表特征。與大部分支原體一樣，牛支原體是一種宿主特異性粘膜常在菌，在牛的呼吸道黏膜、腸道黏膜，泌尿生殖到黏膜，乳腺黏膜、眼結膜均可存在，其主要生存方式是作為寄生或作為條件致病菌的共生關系(Gevaert,2006;Pfutzner&Sachse,1996)。健康牛上呼吸道黏膜的牛支原體，在應激條件下，如長途運輸、天機驟變，管理不良等原因，可以轉移到其他部位，引起多種疾病(Maunsell&Donovan,2009)。

自Nocard在1898年從患肺炎的病牛胸前積液這兩個分離到絲狀支原體絲狀亞種（MmmSC）以來，人們一直認為MmmSC引起的牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)是危害養牛業最重要的傳染病。然而，1961年康奈爾大學的hela發現的牛支原體逐漸引起全世界的重視。

牛支原體能夠引起肺炎，中耳炎，乳房炎、角膜結膜炎等與M.bovis相關的疾病被簡稱為MbAD。MbAD在歐洲和北美廣泛流行，造成了非常嚴重的經濟損失。在英國每年超過190萬頭牛感染呼吸道疾病，約有157000頭小牛死于肺炎和相關疾病，至少有1/4-1/3是由牛支原體引起的。在美國，由于牛支原體導致乳房炎引起的損失比呼吸道引起的損失更加嚴重，每年約為1.08億美元。MbAD病原牛支原體于1961年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離到，1976確認為牛支原體感染。牛支原體在分類上地位上屬于支原體科支原體目支原體屬成員，目前由于缺乏牛支原體基因組的完整數據，所有研究工作仍然以全菌體蛋白組分與免疫血清的免疫結果為基礎進行。

2008年中國湖北省首先出現牛支原體的病例報告，此后，寧夏，貴州等十多個省市自治區相繼出現由牛支原體引起的死亡病例。據我們的統計，MbAD的死亡率可以達到38％，而且臨床癥狀與已經在中國消滅的牛傳染性胸膜肺炎（OIE規定必須報告的傳染病CBPP）相似，所以最初是被當做CBPP卷土重來而引起了獸醫界的廣泛關注和焦慮。牛支原體病的快速診斷因而被提上日程。

2012年，任澤民、姜勇等以牛支原體湖北分離株HB0801作為抗原免疫8周齡BALB/C小鼠，利用雜交瘤技術篩選出了6株能穩定分泌抗牛支原體的單克隆抗體細胞株，分別生產腹水并對單抗進行了純化和特性鑒定。但是ELISA特異性分析結果表明，這6株單抗不僅與臨床分離的牛支原體菌株以及ATCC標準株PG45顯陽性反應，同時所有制備的單抗都與無乳支原體PG2有交叉反應，因此無法實現對牛支原體的特異性檢測（任澤民、姜勇等，牛支原體單克隆抗體的制備與鑒定，中國畜牧獸醫，2012年第39卷第7期）。

因此，建立一種快速、高通量的針對牛支原體感染的血清抗體檢測方法就顯得十分重要了。

發明內容