[發明專利]重組人血清白蛋白/血小板源性生長因子融合蛋白

在審

• 申請號: 201310335639.0
• 申請日: 2007-06-06
• 公開（公告）號: CN104004096A
• 公開（公告）日: 2014-08-27
• 發明（設計）人: 于在林;富巖
• 申請（專利權）人: 天津林達生物科技有限公司;北京美福源生物醫藥科技有限公司;天津溥瀛生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/38;A61K38/30;A61K38/18;A61K47/48;A61K8/64;A61P17/02;A61Q19/00
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技術領域

本發明是中國發明專利ZL200710057571.9的分案申請，也是中國發明專利ZL201110211843.2的繼續分案申請，也是中國發明專利ZL021428816和ZL2004100428148的繼續申請。本發明涉及基因重組及表達的人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法，并涉及單一融合蛋白或不同融合蛋白組合使用的方法。特別涉及利用酵母菌表達生產由人血清白蛋白與人細胞生長因子所形成的融合蛋白(HSA/GF)。細胞生長因子包括：表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板源性生長因子(PDGF)、角質細胞生長因子(KGF)和類胰島素生長因子(IGF)等。?

背景技術

人血清白蛋白(HSA)是一種可溶性單體蛋白質，構成血液中蛋白總量的一半。白蛋白作為一種基本載體，攜帶傳遞脂肪酸、類固醇和激素分子等，其穩定的惰性性質是維持血壓的一個重要因素。血清白蛋白是一種球狀非糖基化的、分子量為65千道爾頓、具有585個氨基酸的血清蛋白質。這一蛋白(白蛋白前體)再通過高爾基體的轉化加工，去除引導多肽，而分泌到細胞外。血清白蛋白有35個半胱氨酸，在血液中，白蛋白是一個有17個二硫鍵的單體(參見Brown?JR，“白蛋白的結構、功能和應用”Pergamon，紐約，1977)。當沒有分泌多肽時，在酵母細胞內的白蛋白產物是錯配狀態，將失去90％的抗原性(與血漿中自然狀態白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合體，不具有白蛋白的生物活性。現在用于臨床的白蛋白均是從人血漿中提取的。利用微生物重組表達白蛋白(rHSA)的生產已在專利EP330451、EP361991和中國專利申請CN2004010057313.7中公開。?

白蛋白是血液中的主要成分，在人體內含量為每升血液含40克，其半衰期壽命為14-20天。綜上所述，治療性蛋白質與白蛋白形成融合蛋白后，融合蛋白將具有極大的優勢使之可抵御生物體內酶解作用，并可使治療性蛋白質在體內體外的壽命大大提高，還可以較高劑量使用。?

人源或重組人血清白蛋白在美容產品中的使用也獲得了十分有意義的實際應用，并在專利CN01810411.8中有具體的描述。?

在藥物制劑組成中，白蛋白也常被用作藥物的穩定劑，尤其是生物藥。?

利用基因工程技術，將人血清白蛋白與治療性蛋白質基因融合在酵母菌中表達為融?合蛋白，可增加治療性蛋白質在血清中和儲存時的穩定性，和較長的半衰期，達到蛋白藥物的長效化。該項蛋白藥物體內修飾公共技術平臺，在于在林、富巖中國授權專利ZL02142881.6和ZL200410042814.8中己公開，在此引為參考文獻。?

發明內容

本發明者通過動物和細胞的體內體外實驗證明了人血清白蛋白與細胞生長因子形成的融合蛋白可刺激細胞增生，并具有比單體的細胞生長因子在體內和體外停留更長的時間(長半衰期和持續性)，細胞和動物實驗還發現融合蛋白具有與治療性蛋白單體相同的摩爾生物活性。當復合使用由HSA和不同生長因子形成的融合蛋白(HSA/GF)的組合時，可具有同時刺激多種皮膚細胞的修復和具協同增效作用，而適用于美容、創傷和疾病的治療，由此完成了本發明。?

本發明所涉及的細胞生長因子(GF)包括但不局限于，表皮細胞生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、角質細胞生長因子(KGF-2)和類胰島素細胞生長因子(IGF)。下面就其特性分別簡述如下：?

①表皮細胞生長因子(Epidiuen?cell?Growth?Factor，EGF)：是EGF是人體分泌的由五十三個氨基酸所組成的具有生物活性的蛋白質，它廣泛分布在血液、唾液、尿液等體液中。它具有廣泛的生物學活性，能促進表皮細胞的分裂，加速細胞的新陳代謝，使新生的表皮細胞迅速替代老化的細胞(Carpenter，實驗細胞研究，164：1-10，1986)。?

②角質細胞生長因子(Keratinocyte?Growth?Factor，KGF，KGF-2)：有多種角質細胞生長因子存在在動物體中。以KGF-2(也叫FGF10)是一種由208個氨基酸組成的堿性蛋白，來源于胚胎上皮細胞、新生或成年間質成纖維細胞的KGF。KGF-2具有促進上皮細胞有絲分裂的作用。能通過吸引成纖維細胞和結締組織向傷口處移行，促進損傷上皮的修復，表現為溫和的促細胞再生作用(Rubin?JS等，美國國家科學院院報86：802-806，1989；CN00809802.6)。?