[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)重組狒狒尿酸氧化酶的技術(shù)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310335535.X
• 申請(qǐng)日: 2013-08-05
• 公開（公告）號(hào): CN104342414A
• 公開（公告）日: 2015-02-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳勁春;熊潤(rùn)松
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/06
• 分類號(hào): C12N9/06;C12N15/70;A61K38/44;A61P19/06
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明基因工程酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及狒狒尿酸氧化酶基因的克隆表達(dá)方法，本發(fā)明還涉及該酶的分離純化方法。?

背景技術(shù)

尿酸氧化酶是生物體內(nèi)嘌呤代謝途徑中的一個(gè)酶，以氧作為受體,能夠催化尿酸氧化生成尿囊素和過氧化氫(Richette等Lancet2010,318-328)。尿酸氧化酶在生物界廣泛存在。從古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、酵母、放線菌、植物、魚類、兩棲動(dòng)物和大多數(shù)非靈長(zhǎng)目哺乳動(dòng)物及少數(shù)靈長(zhǎng)目動(dòng)物體內(nèi)均能找到尿酸氧化酶。但是在人類和高等靈長(zhǎng)目動(dòng)物，由于尿酸氧化酶基因在進(jìn)化過程中發(fā)生無(wú)義突變，致使這些物種，如猿類體內(nèi)沒有尿酸氧化酶存在(Wu等,PNAS1989,9412-9416)。由于缺少尿酸氧化酶，嘌呤代謝產(chǎn)生的尿酸不能被進(jìn)一步氧化而最終以尿酸的形式通過腎臟排出體外，導(dǎo)致人體內(nèi)尿酸的濃度明顯比其他動(dòng)物高。高濃度的尿酸存會(huì)給人體帶來(lái)許多嚴(yán)重的疾病，如高尿酸血癥，痛風(fēng)，腫瘤溶解綜合癥等。?

尿酸氧化酶被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用于醫(yī)療始于1974年(Fam等,Current?rheumatology?reports2005,29-35)。當(dāng)時(shí)使用的是從黃曲霉中提取得到的尿酸氧化酶。之后各種來(lái)源的尿酸氧化酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并被用于研究。但是由于純度不高，難于控制，在使用中產(chǎn)生各種各樣的副作用。八十年代，隨著基因工程技術(shù)的興起，重組表達(dá)尿酸氧化酶逐漸成為獲取尿酸氧化酶的主要途徑。現(xiàn)今已有多個(gè)物種的重組尿酸氧化酶表達(dá)成功。Suzuki等(Suzuki等,Plant?Physiology1990,384-389)于1990年成功地將大豆尿酸氧化酶基因克隆到大腸桿菌表達(dá)。1996年，Candida?utilis尿酸氧化酶在大腸桿菌中成功表達(dá)(Koyama等,J.Biochem.1996,969-973)。Legoux等(Legoux等,JBC1992,8565-8570)通過將黃曲霉尿酸氧化酶基因克隆到大腸桿菌中,發(fā)現(xiàn)尿酸氧化酶在細(xì)胞內(nèi)以可溶性表達(dá)形式存在。Ishikawa等(Hongoh等，Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology2000,173-182)成功地將Nilaparvata?lugens尿酸氧化酶基因克隆在大腸桿菌中表達(dá)，但是表達(dá)量并未提供。?

重組尿酸氧化酶在臨床上的應(yīng)用則始于1995年，Rozenberg等首次利用?重組尿酸氧化酶用于心臟移植病人的痛風(fēng)石治療(Rozenberg等,Rev.Rhum.Engl.Ed.,1995,62(5),392-394),證明了重組尿酸氧化酶在醫(yī)療上的巨大前景。2001年，由Sanofi-Synthélabo公司研發(fā)的重組黃曲霉尿酸氧化酶注射劑在歐洲成功上市，并于2003年獲準(zhǔn)在美國(guó)上市，用于高尿酸血癥的預(yù)防和治療（腫瘤化療高尿酸血癥的治療和預(yù)防）。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過重疊延伸法獲得了狒狒尿酸氧化酶基因的全序列，從而解決了天然來(lái)源的狒狒尿酸氧化酶不易獲得的問題。?

尿酸是一種弱酸，pKa值為5.75。在生理pH7.4條件下，98%的尿酸以尿酸鹽的形式存在^[14]。尿酸鹽在血液中的溶解度僅為380μmol/L。當(dāng)人體內(nèi)尿酸鹽濃度超過此值時(shí)，尿酸鹽將以晶體的形式析出，并隨著血液循環(huán)而逐漸沉積在人體的關(guān)節(jié)處，由此而引發(fā)一系列相關(guān)的疾病，如高尿酸血癥、痛風(fēng)等。?

高尿酸血癥是指血液中尿酸含量大于420μmol/L(7.0mg/dL)，高尿酸與糖尿病、高血壓、肥胖或高膽固醇血癥等幾乎所有的成人病都有密切的關(guān)系，也可能導(dǎo)致腎障礙、動(dòng)脈硬化、腦中風(fēng)、心臟病等嚴(yán)重的疾病，因此是非常重大的代謝異常癥狀。?

痛風(fēng)是一種古老的疾病。早在公元前2640年就有古埃及文獻(xiàn)對(duì)于痛風(fēng)的記載。確切的臨床記載則見于公元前400年Hippocratc的醫(yī)學(xué)著作中。其病因便是由于尿酸沉積在關(guān)節(jié)處形成所謂的痛風(fēng)石而引發(fā)的一種急性關(guān)節(jié)炎。古代關(guān)于痛風(fēng)患者的記載主要見于帝王顯貴，因而痛風(fēng)又有帝王病之稱。同時(shí)由于其發(fā)病時(shí)給病人帶來(lái)巨大的痛苦又被稱為疾病之王。現(xiàn)今，痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，尤其以西方發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)重。據(jù)有關(guān)組織統(tǒng)計(jì)，英國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率1970年為0.3%，1990年為1%，到2005年，這一比例上升到了1.4%。美國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率更高，1990年這一比例為2.1%，到1999年已上升到4.1%。隨著經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人們生活水平和飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)痛風(fēng)的發(fā)病率也呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)低齡化。目前我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病率為0.3%，現(xiàn)有400多萬(wàn)痛風(fēng)患者，每年有200多萬(wàn)急性發(fā)作，近100萬(wàn)人因痛風(fēng)致殘。因此痛風(fēng)已成為嚴(yán)重影響人們身體健康的疾病之一。?