[發明專利]桑樹病程相關基因非表達子基因NPR1的克隆及應用

無效

• 申請號: 201310335049.8
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN103397039A
• 公開（公告）日: 2013-11-20
• 發明（設計）人: 冀憲領;蓋英萍;袁傳忠
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明涉及一種桑樹病程相關基因非表達子基因NPR1的克隆及應用，屬于分子生物學和生物技術領域。

二、背景技術

桑樹在長期的進化過程中常常受到一些病原微生物的侵襲,由于桑蠶對農藥敏感，常規的農藥難以在桑園施用，桑樹病害往往造成桑葉產量和質量的降低，是影響蠶桑業發展的重要因素。開發廣譜抗病新資源，培育持久抗病新品種是解決這一問題的根本途徑之一。因此，利用植物本身編碼的抗病基因，通過基因工程技術培育抗病新品種是解決這一問題的根本途徑。植物在長期進化過程中，形成了復雜的防御病原物侵染的抗性機制，這一機制由不同水平的多個抗性途徑交叉、重疊組成，使得植物抗病性具有多種表現形式。不同形式的抗病性信號傳導途徑有區別，也有重疊和交叉。其中的交叉點將是調節植物整體抗病性的重要因子。近年來的研究結果表明，NPR1不僅對系統獲得性抗性和誘導系統抗性起核心調控作用，而且也是基礎抗性以及由抗病基因決定的抗性的重要調控因子，是植物抗病性的關鍵調節基因。通過基因工程技術將NPR1應用于桑樹育種，可以使桑樹避免多種病害的發生，具有光明的應有前景。但關于桑樹NPR1基因的克隆及其在桑樹抗病性中的作用，目前還未見報道。

三、發明內容

本發明的目的旨在提供一種可提高桑樹抗病性的相關基因NPR1，同時提供一種該基因在植物中應用的方法，可提高植物的抗病能力。

本發明中提供的核苷酸序列來自桑樹。

本發明從桑樹（Morus?alba?var.multicaulis）葉片中提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據GenBank中已發布的其他植物NPR1基因編碼蛋白的保守氨基酸序列，設計兼并引物，進行常規聚合酶鏈式反應（Polymerase?chain?reaction,PCR）。將PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選重組子，進行序列分析。然后通過3′和5′末端快速擴增（Rapid-amplification?of?cDNA?ends,RACE）技術分別獲得3′和5′端序列。根據cDNA的3′和5′末端序列設計特異引物，以桑樹的cDNA為模板進行PCR擴增，得到桑樹NPR1的cDNA全長序列，其基因序列如SEQ.ID.NO.1所示，蛋白質氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

桑樹NPR1基因開放閱讀框全長1743bp。由此推演出該基因編碼的蛋白具有580個氨基酸，將蛋白質序列在GenBank中檢索，發現與已發表的ViNPR1（葡萄，XM002281439）、CaNPR1（辣椒，DQ648785）、NPR1（番茄，NM001247629），NiNPR1（煙草，AF480488）等相比，蛋白質同源性分別為72.35%、69.40%、68.38%，68.31%。由此表明，我們成功分離得到了桑樹NPR1基因的全長cDNA。

桑樹NPR1基因序列如下：

序列表

(1)SEQ.ID.NO.1的信息

(a)序列特征

長度：1743bp

類型：核酸

鏈型：雙鏈

拓撲結構：線性

(b)分析類型：cDNA

(c)假設：否

(d)反義：否

(e)最初來源：桑樹（Morus?alba?var.multicaulis）

(f)序列描述：SEQ.ID.NO.1

atggattcca?aaaccggctt?ttccgattcc?aacgagatcc?tgagcaacag?caacagcagc?????60

atatgctgca?tgggccaaaa?actgccctcg?tcgtcggaga?attcaccgcc?gtcggatgtc????120

tcggccctaa?accggctctc?ggagaatctc?cggtcggcct?tcaattcccc?ggagttcgac????180

ttcttagctg?acgcgaggct?cgtcgtgagc?ggcggccggg?aggtccccgt?ccaccggtgc????240

attctggcgg?caagaagcgg?attcttccgg?aacatgttct?gcagatcgcg?ggagaagggt????300