[發明專利]一種測定富含蛋白質樣品中四環素類抗生素殘留的方法

有效

• 申請號: 201310334436.X
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN103543218A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 朱麗華;周茜;王楠;張英英;唐和清
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 夏惠忠

1.一種測定富含蛋白質的樣品中四環素類抗生素的方法，包括以下步驟：

(1)繪制相應的四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線。

(2)取待測的含蛋白質的液體樣品或含水分的含蛋白質的固體樣品或干燥的含蛋白質的固體樣品用lowery法測定樣品中蛋白質的含量。

(3)酶解法除蛋白：稱取經步驟(2)測得蛋白質含量的待測的含蛋白質的樣品，按所稱取樣品中蛋白質摩爾量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超聲8min或100W超聲酶解6min或120W超聲4min，得到酶解液；

(4)四環素類抗生素提取：向步驟(3)得到的酶解液中加入提取劑，用以提取樣品中四環素類抗生素，再用鹽酸調pH為2至3，然后離心收集上清液，所述的提取劑是檸檬酸-乙二胺二鈉(Mcllvaine-Na₂EDTA)緩沖液；

(5)凈化上清液：將步驟(4)得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾后得濾液；

(6)利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素抗生素濃度：將液相色譜儀中得到的峰面積代入步驟(1)所作標準曲線中，求得抗生素濃度。

2.根據利要求1所述的方法，其特征在于：所述的含蛋白質的液體樣品是蛋白質溶液或血漿；所述的含水分的含蛋白質的固體樣品是動物組織或內臟；所述的干燥的含蛋白質固體樣品是飼料。

3.根據利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的用lowery法測定樣品中蛋白質含量的具體方法是：含蛋白質的液體樣品直接測定；含水分的含蛋白質的固體樣品冷凍干燥后研磨過50目篩取篩下部分測定；干燥的含蛋白質的固體樣品研磨過50目篩取篩下部分測定。

4.按權利要求1所述的的方法，其特征在于，步驟(5)所述的將步驟(4)得到的上清液通過親水親油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分離，萃取富集收集洗脫液，過濾后得濾液的具體方法是；將步驟(4)收集的上清液采用HLB固相萃取柱分離，先用甲醇和水活化小柱，上樣后用5mL5％甲醇水溶液淋洗，再用8mL30％甲醇-乙酸乙酯洗脫，萃取富集收集洗脫液在40℃下氮吹至近干，用1mL甲醇復溶，之后溶液過0.22μm濾膜得濾液。

5.按權利要求1所述的的方法，其特征在于，步驟(6)所述的利用高效液相色譜測定步驟(5)得到的濾液中的四環素類抗生素濃度的具體方法是：流動相由甲醇、乙腈和0.1％甲酸組成，三者的體積比為1∶2∶7，柱溫為30℃，進樣量為20μL，紫外檢測器波長設定為355nm，質譜檢測器設置參數為毛細管電壓：2.5kV；錐孔電壓：17V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：550L?h^-1。

6.按權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的四環素類抗生素是土霉素、四環素、金霉素、強力霉素或去甲基金霉素。

7.按權利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的相應的四環素類抗生素液相色譜串聯質譜法標準曲線的濃度范圍為0.4mg?L^-1-1.5mg?L^-1。