[發(fā)明專利]Rictor/mTORC2在心臟發(fā)育和疾病治療中的藥物用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310334338.6
• 申請(qǐng)日: 2013-08-05
• 公開（公告）號(hào): CN103439513A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱丹雁;鄭蓓;黃玉潔;湯磊磊;樓宜嘉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N15/14
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬發(fā)育生物學(xué)，藥理學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種蛋白質(zhì)新功能的研究與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及rictor/mTORC2（哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2，mammalian?target?of?rapamycin?complex?2，mTORC2）在小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞中的新功能，可用于以rictor/mTORC2為靶點(diǎn)的促心肌細(xì)胞分化劑篩選。本發(fā)明還證實(shí)了rictor/mTORC2與心肌肥大的關(guān)聯(lián)性，可用于抗心肌肥大疾病藥物的開發(fā)研究。

背景技術(shù)

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian?target?of?rapamycin，mTOR）是細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化的中心調(diào)控者，通過結(jié)合不同的蛋白形成兩種復(fù)合物mTORC1（mammalian?target?of?rapamycin?complex?1）和mTORC2（mammalian?target?of?rapamycin?complex?2）。mTORC2包括mTOR、mTOR的雷帕霉素不敏感組分（rapamycin-insensitive?companion?of?mTOR，rictor）、mSin1（mammalian?stressactivated?protein?kinase-interacting?protein?1）、PRR5（prolin-rich?repeat?protein-5）和mLST8（mammalian?lethal?with?sec13?protein?8）蛋白。其中rictor是保證mSin1穩(wěn)定和維持mTORC2活性所必需的。過去幾十年國(guó)內(nèi)外研究主要集中于mTORC1，而對(duì)mTORC2在各種生理/病理狀態(tài)（包括心臟發(fā)育/心臟疾病等）的功能知之甚少。

mTOR在胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)分化過程中是必需的，且mTORC1和?mTORC2在不同胚層細(xì)胞分化中起著不同的作用。Rictor敲除的小鼠胚胎發(fā)育至E9.5表現(xiàn)出生長(zhǎng)阻滯，且在E11.5死亡，推測(cè)與胚胎細(xì)胞缺失rictor后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生不足，代謝失衡有密切關(guān)系，但其具體機(jī)制尚未闡明。同時(shí)，mTORC2?參與細(xì)胞骨架蛋白構(gòu)建和細(xì)胞遷移過程。迄今尚未見rictor/mTORC2與胚胎心臟分化發(fā)育及心臟疾病發(fā)生相關(guān)性的報(bào)道。因此，深入揭示rictor/mTORC2在心臟生理/病理發(fā)生發(fā)展中所起的作用，開發(fā)以rictor/mTORC2為靶點(diǎn)的新藥物，為心臟疾病的防治提供新途徑與方法，并有利于再生醫(yī)學(xué)中終末期心臟疾病的藥物干預(yù)治療，具有廣闊研究前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供rictor/mTORC2在小鼠胚胎干細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞中的應(yīng)用，即可應(yīng)用于篩選與評(píng)價(jià)以rictor/mTORC2為靶點(diǎn)的促心肌細(xì)胞分化劑的研究。本發(fā)明證實(shí)小鼠胚胎干細(xì)胞通過基因慢病毒shRNA干擾rictor后，能顯著抑制其定向分化為心肌細(xì)胞。表現(xiàn)為分化時(shí)抑制了中胚層特異性蛋白brachyury、心肌轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和心肌特異性蛋白????????????????????????????????????????????????-Actinin的表達(dá)。心肌細(xì)胞數(shù)量也顯著減少。同時(shí)，干擾rictor組分化而來的心肌細(xì)胞肌小節(jié)發(fā)生紊亂，明暗相間不明顯。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抑制rictor表達(dá)的化合物PP242不利于心肌細(xì)胞分化，而促進(jìn)rictor表達(dá)的化合物淫羊藿苷有利于心肌細(xì)胞分化。即利用本發(fā)明可應(yīng)用于以rictor/mTORC2為靶點(diǎn)的促心肌細(xì)胞分化劑的篩選與評(píng)價(jià)，有利于發(fā)現(xiàn)新一類心肌分化誘導(dǎo)劑。

本發(fā)明提供一種新的心肌細(xì)胞肥大模型，應(yīng)用于篩選與評(píng)價(jià)以rictor/mTORC2為靶點(diǎn)的抗心肌肥大藥物研究。本發(fā)明利用percoll試劑純化出由小鼠胚胎干細(xì)胞體外定向分化而來的心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染編有rictor的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄輔激活子p300的質(zhì)粒，使心肌細(xì)胞中rictor乙?；皆黾樱M(jìn)而促進(jìn)rictor下游效應(yīng)器Akt（ser473）磷酸化，增加mTORC2活性，從而構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型。并進(jìn)一步利用該模型，評(píng)價(jià)了白藜蘆醇抗心肌肥大的作用。

附圖說明

圖1為?ES-D3細(xì)胞干擾rictor后對(duì)其定向分化為心肌細(xì)胞的影響，**P<0.01，***P<0.001?vs?溶劑對(duì)照組。

圖2為Western?blot法檢測(cè)ES-D3細(xì)胞干擾rictor后對(duì)心肌細(xì)胞分化時(shí)心肌特異性蛋白表達(dá)的影響。