[發(fā)明專利]一種用于檢測毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的前處理方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310334157.3
• 申請日: 2013-08-02
• 公開（公告）號: CN103353535A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 連玉龍;肖靜;劉繼文;姜雨;陳龍;許仙
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 北京商專永信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物內(nèi)分泌系統(tǒng)數(shù)據(jù)檢測方法，尤其涉及一種皮質(zhì)醇的檢測方法。

背景技術(shù)

目前，頭發(fā)中皮質(zhì)醇（Cor.）的檢測，LC-MS法、酶聯(lián)免疫吸附法及放射免疫法都被研究中用到。由于考慮到檢測靈敏度和特異性，以及檢測成本的優(yōu)越性，利用放射免疫法檢測頭發(fā)中的痕量皮質(zhì)醇，成為目前測量頭發(fā)中皮質(zhì)醇的一個重要方法。

由于頭發(fā)易受到外界環(huán)境污染等多方面因素，同時又不同于血清、尿液等檢測介質(zhì)，傳統(tǒng)的采用手工剪碎、磨粉機(jī)磨碎、甲醇萃取等方法造成皮質(zhì)醇提取量低，手工剪碎的過程還容易造成局部高溫和發(fā)樣粉碎不均的情況，嚴(yán)重影響檢測結(jié)果穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的提供一種用于檢測毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的前處理方法，提高皮質(zhì)醇檢測的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度。

本發(fā)明提供了一種用于檢測毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的前處理方法，包括以下步驟，S1、取毛發(fā)樣品，并將樣品去角質(zhì)化；S2、將S1去角質(zhì)化后的樣品進(jìn)行液氮冷凍；S3、將經(jīng)S2中液氮冷凍后的樣品研磨粉碎；S4、萃取S3中粉碎后的樣品，再干燥萃取后的混合溶液，將干燥所得溶質(zhì)加入緩沖液。

本發(fā)明提出了一種用于檢測毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的前處理方法，在正常剪碎后需經(jīng)液氮冷凍研磨的處理，避免了局部高溫和發(fā)樣粉碎不均的情況，得到更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定的數(shù)據(jù)。

在一些實(shí)施方式中，S1中樣品去角質(zhì)化采用異丙醇浸泡。采用異丙醇浸泡的方法，不僅可以去除角質(zhì)蛋白，有利于后續(xù)的萃取，還可以有清洗毛發(fā)的作用。

在一些實(shí)施方式中，S4中萃取使用體積比為5：3的甲醇與乙醚的混合溶液作為萃取溶劑。采用甲醇與乙醚的混合溶液進(jìn)行萃取，操作簡單，容易實(shí)施，本發(fā)明采用體積比為5：3的甲醇與乙醚的混合溶液，可進(jìn)一步提高測量穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

在一些實(shí)施方式中，S4中緩沖液選用磷酸緩沖液。

在一些實(shí)施方式中，S4中干燥選用氮吹儀。大大提高干燥速度。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括S4后的S5—冰箱冷藏儲存至檢測日。一般將采用-4℃的冷藏條件。

在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括S4后的S6—使用放射免疫試劑通過自動放免儀測定。本發(fā)明可作為放射免疫法測定毛發(fā)中皮質(zhì)醇含量的前處理。檢測靈敏度較高。

在一些實(shí)施方式中，S6中取溶質(zhì)與緩沖液的混合液的上層清液進(jìn)行測定。上清液的檢出水平更加穩(wěn)定合理。因?yàn)槠べ|(zhì)醇作為激素存在人體，經(jīng)過處理將皮質(zhì)醇提出溶于溶劑中，離心作用后雜質(zhì)沉淀，上清液中的激素水平相對穩(wěn)定，檢出的穩(wěn)定性也隨之升高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明第一次試驗(yàn)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2為本發(fā)明第二次試驗(yàn)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

本實(shí)驗(yàn)基于放射免疫法，設(shè)置不同實(shí)驗(yàn)條件的對照組進(jìn)行試驗(yàn)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果后擇選出最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件，修正人體頭發(fā)中皮質(zhì)醇水平測定的樣品前處理方法。

1.1試驗(yàn)采用儀器與試劑

表一：試驗(yàn)采用的儀器設(shè)備

表二：試驗(yàn)采用的試劑

1.2溶液配制

磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）:將1.5g混合磷酸鹽倒入250ml容量瓶內(nèi)，以少量無CO₂蒸餾水沖洗試劑袋內(nèi)壁，沖洗水也加入上述250ml容量瓶中，并用無CO₂蒸餾水稀釋到刻度搖勻，用3mol/L的NaOH調(diào)至pH至7.35。

取適量的標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為分別為0、10、50、100、200、500ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

上述皮質(zhì)醇放免試劑盒包括用來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)品，以及配制好的兔抗-Cor.抗體、驢抗兔免疫分離劑。

2.第一次試驗(yàn)

2.1第一次試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別采集男性、女性發(fā)樣，試驗(yàn)為預(yù)試驗(yàn)，未設(shè)置空白對照和質(zhì)控組，將男女發(fā)樣分別作兩個平行發(fā)樣，此次試驗(yàn)采用正常剪碎發(fā)樣的處理方式，在運(yùn)用放射免疫法測定時，分為測定上清液、渾濁液。

根據(jù)上述，本次測定共有八個樣品號，具體分組如下：

表三中樣品組取上層清液測量；

表三：樣品組一（上層清液測定組）