[發(fā)明專利]高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310334134.2
• 申請(qǐng)日: 2013-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN103436454A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黎明;路福平;劉萌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N15/54;C12N15/63;C12R1/685
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因工程菌株及其構(gòu)建方法，尤其是一種高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶（α-transglucosidase，EC?2.4.1.24），又稱α-葡萄糖苷酶、轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，它可以從低聚糖類底物的非還原性末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)糖類底物形成α-1，6糖苷鍵，從而得到非發(fā)酵性的功能低聚異麥芽糖（IMO）、糖脂或糖肽等。α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶是一種重要的工業(yè)用酶，在食品、飼料、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，特別是在IMO生產(chǎn)中的巨大應(yīng)用潛力早已引起國(guó)內(nèi)外食品工業(yè)界的重視。

目前，我國(guó)還沒有規(guī)模化生產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的能力，工業(yè)上所用的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶主要依賴于進(jìn)口，價(jià)格昂貴。國(guó)內(nèi)關(guān)于α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的研究也主要集中于產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶菌株的篩選、誘變及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面，效果均不太理想，誘變株的穩(wěn)定性較差，酶產(chǎn)量還是偏低，并且難以純化。近幾年來，隨著基因工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，構(gòu)建和利用基因工程菌作為大規(guī)模生產(chǎn)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的宿主，進(jìn)一步提高酶活及酶的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，成為研究該酶制劑的一種新途徑，并在世界范圍內(nèi)得到越來越廣泛的重視及應(yīng)用。1997年，Akira?N等從黑曲霉工業(yè)菌株GN-3中克隆出α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，并將該基因引入到Emericella?nidulans中表達(dá)，表達(dá)量為0.96?U/mg蛋白。1999年，Galichet?A等從Thermococcus?hydrothermalis?AL662菌株中，通過建立基因文庫，克隆了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，將該基因克隆到Sulfolobus?solfataricus突變株TCY70?中，但其表達(dá)量較低。2001年，Martino?A等以硫磺礦硫化葉菌MT-4總DNA為模板，通過PCR將α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因克隆到E.?coli中表達(dá)，其表達(dá)量達(dá)到87.5?U/g?濕菌體。2004年，蘇艷利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)黑曲霉α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，酶活高達(dá)226.8?U/mL。2008年，楊捷琳等從阪崎腸桿菌中克隆α-葡萄糖苷酶基因，重組到pET22b（+）質(zhì)粒在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)及活性研究，目標(biāo)蛋白量約占菌體總蛋白量的18%。2009年，童星等以畢赤酵母KM71為宿主菌表達(dá)黑曲霉SG136?α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)苷活性進(jìn)行測(cè)定，制備的粗酶液在最適pH和溫度下反應(yīng)24?h時(shí)，低聚異麥芽糖的總含量達(dá)到最大為26.0%。

我國(guó)關(guān)于α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的研究起步較晚，為了改變依賴于進(jìn)口這一現(xiàn)狀，尋求一條國(guó)產(chǎn)化的道路，本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建基因工程菌株，進(jìn)一步提高酶的產(chǎn)量及活性，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請(qǐng)相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種增加了α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的拷貝數(shù)，有效提高了酶的表達(dá)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)的高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法易于操作、方法簡(jiǎn)單，而且可以構(gòu)建含有不同基因拷貝數(shù)和在基因組位置不同的工程菌。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株的宿主菌為黑曲霉（Aspergillus?niger），該基因工程菌株包含α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒。

而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因的來源為黑曲霉。

而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中含有糖化酶啟動(dòng)子、糖化酶信號(hào)肽、α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因和色氨酸終止子。

而且，所述α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶基因表達(dá)盒中的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶成熟肽基因的N-末端融合了糖化酶信號(hào)肽。?

如上所述的高效表達(dá)α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下：

⑴根據(jù)GenBank中已報(bào)道的糖化酶啟動(dòng)子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉基因組DNA為模板擴(kuò)增糖化酶啟動(dòng)子序列；

⑵根據(jù)GenBank中已報(bào)道的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶mRNA序列、糖化酶信號(hào)肽序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以黑曲霉總RNA為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增得到含有糖化酶信號(hào)肽的α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶的成熟肽基因；

⑶根據(jù)GenBank中已報(bào)道的色氨酸終止子序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒pBI-hph為模板擴(kuò)增得到色氨酸終止子序列；