[發明專利]利用花粉介導反義表達S-RNase創制梨自交親和新種質的方法

有效

• 申請號: 201310331340.8
• 申請日: 2013-08-01
• 公開（公告）號: CN103382484A
• 公開（公告）日: 2013-11-06
• 發明（設計）人: 吳俊;張紹鈴;馬倩倩;齊開杰;黃小三;吳巨友
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

1.利用花粉介導反義表達S‐RNase創制梨自交親和新種質的方法，其特征在于包含以下步驟：

（1）構建反義表達載體pGSA1285‐S₃：

①根據S₃-RNase基因的mRNA序列，設計正反向引物S₃PF：SEQ?ID?NO.1、S₃PR：SEQ?ID?NO.2，以‘豐水’梨花柱cDNA為模版，PCR擴增獲取S₃‐RNase基因cDNA序列全長；

②將S₃‐RNase基因全長轉化PMD19載體，以轉化質粒為模板，用帶有酶切位點的特異引物S₃‐PF₂：SEQ?ID?NO.3和S₃‐PR₂：SEQ?ID?NO.4PCR擴增長度為449bp的S₃‐RNase基因反義表達片段，將帶有酶切位點的反義表達片段轉化PMD19載體，獲得含S₃‐RNase基因反義表達片段的PMD19重組質粒PMD‐S₃；

③對重組質粒PMD‐S₃以及真核表達載體pGSA1285進行Nco?I/BamH?I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別回收S₃‐RNase基因反義表達片段和pGSA1285線性載體并連接，連接產物轉化至大腸桿菌E.coli?DH5α感受態細胞，挑取氯霉素抗性單克隆，檢測確定為成功構建的反義表達載體pGSA1285‐S₃；

（2）獲得轉基因苗：利用花粉介導轉化pGSA1285‐S₃載體至‘豐水’花柱，完成授粉受精，并獲得后代種子，通過冬季層積處理，春季播種培育獲得幼苗；

（3）PCR檢測轉基因植株：提取上一步獲得的幼苗葉片基因組DNA，以上游引物35S‐F：SEQ?ID?NO.5和下游引物S₃‐PR2：SEQ?ID?NO.4，對樣品DNA進行PCR擴增，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，存在約1000bp的反義表達載體目的片段，確定為自交親和的轉基因植株。

2.根據權利要求1所述的利用花粉介導反義表達S‐RNase創制梨自交親和新種質的方法，其特征在于還包括步驟(4)轉基因植株的自交親和性鑒定：采集植株開花前1～2d的花蕾，切取0.5g左右花柱，通過提取液提取、層析柱分離、蛋白質沉淀和透析，獲得花柱S糖蛋白，計算每1μg花柱可溶性蛋白中含總S糖蛋白含量≦0.7ng，即為自交親和性植株。

3.根據權利要求1所述的利用花粉介導反義表達S‐RNase創制梨自交親和新種質的方法，其特征在于所述的PCR擴增的反應體系為25μL，包括2.5μL10×Buffer，2.0mmol·L^‐1MgCl₂，0.2mmol·L^‐1，0.1μmmol·L^‐1正向引物、0.1μmmol·L^‐1反向引物，0.2μLTaq酶（Takara公司）和60μg模板，PCR擴增程序為：94℃預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，持續38個循環后，72℃延伸10min，10℃10min。

4.根據權利要求1所述的利用花粉介導反義表達S‐RNase創制梨自交親和新種質的方法，其特征在于所述的花粉介導轉化pGSA1285‐S₃載體的方法為：利用花粉介導法，將‘黃花梨’花粉懸浮于15%蔗糖溶液中，先進行超聲波處理，然后再向溶液中加入pGSA1285‐S₃質粒，對混合后的溶液按相同的方式再次進行超聲波處理，然后將處理后的花粉略經沉淀，用毛筆蘸取并涂抹于大蕾期的‘豐水’花柱上，完成授粉受精。

5.根據權利要求4所述的利用花粉介導反義表達S‐RNase創制梨自交親和新種質的方法，其特征在于所述的超聲波處理條件為功率160‐170W、處理時間6S、間隙時間7S、處理次數7次。

6.S‐RNase基因反義表達載體pGSA1285‐S₃在創制自交親和種質中的應用，其特征在于所述的S‐RNase基因反義表達載體pGSA1285‐S₃通過以下方法構建：

①根據S_3‐RNase基因的mRNA序列，設計正反向引物S₃PF：SEQ?ID?NO.1、S₃PR：SEQ?ID?NO.2，以‘豐水’梨花柱cDNA為模版，PCR擴增獲取S₃‐RNase基因cDNA序列全長；

②將S₃‐RNase基因全長轉化PMD19載體，以轉化質粒為模板，用帶有酶切位點的特異引物S₃‐PF₂：SEQ?ID?NO.3和S₃‐PR₂：SEQ?ID?NO.4PCR擴增長度為449bp的S₃‐RNase基因反義表達片段，將帶有酶切位點的反義表達片段轉化PMD19載體，獲得S₃‐RNase基因反義表達片段的PMD19重組質粒PMD‐S₃，對重組質粒PMD‐S₃以及真核表達載體pGSA1285進行Nco?I/BamH?I雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，并分別回收S₃‐RNase基因反義表達片段和pGSA1285線性載體并連接，轉化至大腸桿菌E.coli?DH5α感受態細胞，挑取氯霉素抗性單克隆，檢測確定為成功構建的反義表達載體pGSA1285‐S₃。