[發明專利]編碼重組新城疫病毒的cDNA、由該cDNA拯救的病毒及其在治療惡性腫瘤中的應用

有效

• 申請號: 201310330960.X
• 申請日: 2013-08-01
• 公開（公告）號: CN103352042A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 吳云舟;白福良;李德山;牛澤杉;何金嬌
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/45
• 分類號: C12N15/45;C12N7/01;C12N15/12;C12N15/28;A61K38/17;A61P35/00;C12R1/93
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技術領域

本發明涉及一種編碼重組新城疫病毒的cDNA?rNDV-TRAIL構建,?由該cDNA拯救的病毒及其在治療惡性腫瘤中的應用。

背景技術

惡性腫瘤又稱癌癥，全世界癌癥的發病率正以每年3%的速度遞增，每年因癌癥而死亡人數達600多萬人，我國癌癥的發病率與死亡人數也呈上升趨勢。據統計資料表明我國一些大中城市居民癌癥死亡已占據全部死因的首位，因此，加強惡性腫瘤治療的研究，尋找新型治療腫瘤方法有著極其重要的意義。

新城疫病毒（Newcastle?disease?virus，NDV)是為不分節段單股負鏈RNA病毒，在病毒學分類上將其歸于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬?(Avulavirus)。大量研究表明，NDV可以有效的殺傷腫瘤，而對正常細胞不產生影響。NDV通過啟動不依賴p53的內源性凋亡通路誘導腫瘤細胞凋亡，并激活免疫系統對腫瘤進行識別殺傷和免疫記憶，成為腫瘤治療領域一個新興的關注熱點。

本研究所涉及相關專利為200510097997.8?、200610001693.1。本研究與之前專利有以下不同：1.本研究所用的毒株為新城疫Clone30株，與之前專利的Lasota株不同；2.本研究所應用的功能為惡性腫瘤治療，之前的專利功能為防治禽病二價疫苗；3.本研究外源基因的插入位點為HN與L之間，之前專利為P和M之間；故本專利與之前專利有本質不同。

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related?apoptosis?inducing?ligand，TRAIL)，是腫瘤壞死因子(tumor?necrosis?factor，TNF?)家族的成員之一。TRAIL是由281個氨基酸組成的典型的????????????????????????????????????????????????型跨膜蛋白，它的一個最重要的生物學特點是可以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無明顯毒副作用。此外，抗腫瘤譜廣，與放療及化療藥物之間具有明顯的協同作用。這些特點使其成為抗腫瘤新藥研究?的一個熱點。目前，TRAIL在國外已完成臨床期實驗，證實TRAIL毒副作用低無免疫反應且不會造成任何組織器官受損，并且已進入期臨床研究階段。

發明內容

本發明涉及一段編碼重組病毒的cDNA序列，序列含有SEQ?ID?NOS：1，或由于插入、缺失和突變導致的與SEQ?ID?NOS：1同源性超過90%以上的衍生DNA序列。

本發明還涉及一種權利要求1所述重組病毒的反向遺傳操作系統，該系統包含：

(1)權利要求1所述的序列1；

(2)輔助質粒，包括編碼表達NDV的核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、大聚合酶蛋白（L）的DNA序列；

(3)NDV病毒的病毒復制許可的宿主細胞，如BHK-21細胞。

具體的，構建表達hTRAIL?重組新城疫LaSota病毒株的基因組cDNA,?由該cDNA拯救出具有特異性感染腫瘤細胞新城疫病毒，及其在治療惡性腫瘤中的應用，構建重組新城疫LaSota病毒株rNDV-TRAIL主要通過以下技術方案獲得并驗證其在治療惡性腫瘤中的作用：

取志愿者外周血，提取人外周血總RNA,反轉錄成cDNA,如序列2，3所示，根據GenBank上已發表的人TRAIL基因（序列號GI:117606467），設計PCR引物，完整克隆人TRAIL基因。

取蝕斑純化后NDV?Clone?30提取基因組RNA，反轉錄成cDNA作為模板，分為十段對病毒全基因組進行克隆，并在pBluscript載體上進行組裝。在HN與L基因之間引入酶切位點HpaⅠ、PmeⅠ、AscⅠ、MluⅠ酶切位點。在全長cDNA片段5’端加入T7RNA?聚合酶啟動子，在全長cDNA片段后連入具有自我催化功能的丁肝核酶序列（GenBank?X04451）和T7轉錄終止信號。構建完成的質粒命名為pBR-NDV-Clone30。以NDV基因組為模板，分別克隆NP、P和L基因連于pBluescript質粒T7啟動子下游，分別命名為pBR/NP、pBR/P、pBR/L。

將克隆出的人TRAIL基因用HpaI插入NDV-Clone30株的基因組中構建重組質粒命名為pBR-Clone30-TRAIL。并將pBR-Clone30-TRAIL、pBR/NP、pBR/P、pBR/L共轉染表達T7RNA聚合酶的BHK-21細胞，拯救出重組新城疫病毒rNDV-?TRAIL。